PCR儀基礎(chǔ)知識和實驗室應(yīng)用講解

PCR儀基礎(chǔ)知識和實驗室應(yīng)用01基礎(chǔ)知識各類PCR儀對比0203實時熒光定量PCR儀應(yīng)用04目錄PCR儀相關(guān)配套儀器設(shè)備01基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。分子生物學(xué)技術(shù)PCR原理示意圖：臨床檢驗分析儀器二類醫(yī)療器械01基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識PCR技術(shù)的應(yīng)用：1、醫(yī)學(xué)：病理科（癌癥的診斷）；檢驗科（病原微生物的檢測，如甲肝、乙肝、HIV、麻疹、HPV、SARS、炭疽、寄生蟲等）；產(chǎn)前診斷；法醫(yī)（犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析），個體識別與親子鑒定等2、食品農(nóng)業(yè)：食品微生物檢測（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌等）；轉(zhuǎn)基因食品檢測（轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米等）、食品成分檢測（動物源性成分、植物源性成分）等。3、生物制藥：3、環(huán)境保護(hù)：氣體檢測、土壤監(jiān)測、水監(jiān)測等4、科研：腫瘤的診斷與研究（原癌基因/抑癌基因）、DNA測序、分析突變、中醫(yī)藥研究等。01基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識一.PCR反應(yīng)成分（PCR反應(yīng)體系)：（五要素）1.模板DNA：含有需要擴(kuò)增的DNA片段。2.引物：決定了需要擴(kuò)增的起始和終止位置。3.脫氧核糖三磷酸（dNTP）：4種脫氧核糖核酸，用于構(gòu)造新的互補(bǔ)鏈。4.耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：復(fù)制需要擴(kuò)增的區(qū)域。5.Mg2+:用于激活DNA聚合酶的活性中心。01基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識PCR反應(yīng)的基本步驟：預(yù)變性：94℃~96℃1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（

90～95℃）2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（

40～60℃）3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（

70～75℃）25~40次循環(huán)，目的基因擴(kuò)增：

2n最后在72℃條件下延伸7~10min。01基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識PCR分類：普通PCR儀

梯度PCR儀原位PCR儀熒光定量PCR儀02基礎(chǔ)知識PCR儀對比儀器分類產(chǎn)品特點(diǎn)主要用途普通PCR儀一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個特定退火溫度的PCR儀。（定性檢測：PCR儀+電泳儀+凝膠成像系統(tǒng)）醫(yī)學(xué)臨床檢驗，食品檢測，科研機(jī)構(gòu)，高等院校教學(xué)對遺傳變異，基因表達(dá)等進(jìn)行研究。梯度PCR儀一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。主要：科研機(jī)構(gòu)，醫(yī)學(xué)臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。原位PCR儀主要是應(yīng)用對細(xì)胞或組織內(nèi)的DNA片段進(jìn)行原位擴(kuò)增分析-即定位分析。無需將細(xì)胞破碎提取DNA，細(xì)胞內(nèi)有DNA酶的作用擴(kuò)增受到一定的影響，使用不是很普遍。主要用于醫(yī)學(xué)臨床研究，如癌細(xì)胞等。

實時熒光定量PCR儀在普通PCR儀設(shè)計基礎(chǔ)上增加熒光信號采集系統(tǒng)和計算機(jī)分析處理系統(tǒng)。與普通PCR儀，梯度PCR儀相比，無需做電泳分析，實驗一步檢測完成。動物疾病檢測：禽流感、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測?？茖W(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究、大學(xué)及研究所等。03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（臨床檢驗）實驗：實時熒光定量PCR檢測HPV-DNA在宮頸癌篩查中的應(yīng)用目的：探討HPV與宮頸病變的關(guān)系。實驗方法：

樣品采集DNA提取PCR檢測結(jié)果判斷移液器、混勻儀、金屬浴、高速冷凍離心機(jī)、微型離心、生物安全柜熒光定量PCR儀03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（臨床檢驗）實驗方法：

03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（食品、農(nóng)業(yè)）實驗：水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR檢測方法主要儀器：實時熒光定量PCR儀；天平；冷凍研磨儀；消毒滅菌鍋；制冰機(jī)；核酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機(jī)；臺式小型離心機(jī)；Mini個人離心機(jī)；低溫冰箱；旋渦振蕩器；金屬浴；微量移液器。實驗流程：

制樣DNA提取DNA濃度測定PCR反應(yīng)結(jié)果分析DNA模板制備03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（食品、農(nóng)業(yè)）DNA模板的制備：

天平，微量移液器，制冰機(jī)，旋渦振蕩器，高速冷凍離心機(jī)，金屬浴，小型臺式離心機(jī)，Mini個人離心機(jī)，低溫冰箱（-20℃），DNA提取試劑盒03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（食品、農(nóng)業(yè)）DNA濃度測定：

核酸蛋白分析儀/紫外分光光度計03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（食品、農(nóng)業(yè)）PCR反應(yīng)：1、陽性對照、陰性對照、空白對照2、PCR反應(yīng)體系：

3、儀器設(shè)置：設(shè)置樣品名稱、報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的種類、熒光信號收集等。03基礎(chǔ)知識熒光定量PCR儀應(yīng)用（食品、農(nóng)業(yè)）PCR反應(yīng)：4、PCR反應(yīng)參數(shù)：實時熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)

5、PCR反應(yīng)運(yùn)行結(jié)果分析03基礎(chǔ)知識PCR儀相關(guān)配套儀器設(shè)備PCR實驗室布局圖：

03基礎(chǔ)知識PCR儀相關(guān)配套儀器設(shè)備

儀器設(shè)備主要用途天平（0.1mg）樣品稱量微量移液器試樣、試劑的移取。（單道：0.2~2uL，2uL~10uL，20uL~100uL，100uL~1000uL；多道：50uL~300uL）純水機(jī)提供試劑配制等實驗用水（一級水）藥品冷藏箱（2~8℃）用于藥品、試劑的保存。低溫冰箱（-20℃或-80℃）用于樣品和試劑的保存?；靹騼x震蕩混勻超凈工作臺用于試劑的配置以及擴(kuò)增區(qū)操作。（樣品制備區(qū)/擴(kuò)增區(qū)）紫外消毒車實驗室空氣及實驗臺滅菌。生物安全柜樣本制備區(qū)的實驗操作，防止樣品污染，建議選B2）離心機(jī)（高速冷凍/普通/微型離心機(jī)）用于DNA提取過程中物質(zhì)的分離漩渦振蕩器用于DNA提取過程中試樣的震蕩混勻。制冰機(jī)為DNA提取提供冰浴環(huán)境。金屬浴為實驗提供恒溫環(huán)境。核酸提取儀用于DNA/RNA的自動提取。03基礎(chǔ)知識PCR儀相關(guān)配套儀器設(shè)備

儀器設(shè)備主要用途PCR儀用于基因擴(kuò)增熒光定量PCR儀用于基因擴(kuò)增與數(shù)據(jù)分析核酸蛋白分析儀用于DNA濃度和純度的測定電爐/微波爐用于瓊脂糖凝膠等的加熱熔化。電泳儀/電泳槽/電泳儀電源用于PCR擴(kuò)增后電泳分離純化凝膠成像系統(tǒng)用于電泳結(jié)果的觀察、分析。分子雜交箱