《酶聯(lián)免疫技術(shù)》課件

酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛的免疫學(xué)檢測方法。簡介定義酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種利用酶標(biāo)記抗體或抗原的免疫化學(xué)檢測方法，通過酶催化底物顯色反應(yīng)來檢測和定量抗體或抗原。應(yīng)用ELISA廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域，在疾病診斷、藥物研發(fā)、生物制品質(zhì)量控制等方面發(fā)揮著重要作用。免疫系統(tǒng)的基本概念1免疫系統(tǒng)機(jī)體抵抗病原體侵襲的防御體系2免疫器官骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等3免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等4免疫分子抗體、抗原、細(xì)胞因子等免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和分類1結(jié)構(gòu)由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，具有可變區(qū)和恒定區(qū)2分類IgG、IgM、IgA、IgD、IgE3功能識別抗原，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，清除病原體抗原-抗體反應(yīng)的基本原理抗原能與免疫系統(tǒng)中的抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的物質(zhì)抗體由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的，能特異性識別并結(jié)合抗原的蛋白質(zhì)反應(yīng)特點特異性、可逆性、親和性應(yīng)用診斷、治療、疫苗研發(fā)等酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的發(fā)展歷程11960s免疫熒光技術(shù)發(fā)展21971年Engvall和Perlmann首次報道ELISA技術(shù)31980sELISA技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷41990sELISA技術(shù)應(yīng)用于食品安全和環(huán)境監(jiān)測52000sELISA技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合，發(fā)展新的檢測方法酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的基本原理1抗原-抗體結(jié)合抗體或抗原被固定在固相載體上，形成固相抗體或抗原2酶標(biāo)記抗體用酶標(biāo)記抗體，與固相抗原或抗體反應(yīng)3顯色反應(yīng)加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生顏色變化4結(jié)果判斷根據(jù)顏色變化的程度判斷樣本中抗體或抗原的含量酶聯(lián)免疫技術(shù)的主要類型直接法ELISA用酶標(biāo)記的抗體直接與抗原反應(yīng)間接法ELISA用酶標(biāo)記的抗抗體與與抗原結(jié)合的抗體反應(yīng)競爭性ELISA加入已知濃度的酶標(biāo)記抗原與待測抗原競爭結(jié)合抗體夾心式ELISA用兩種抗體夾住待測抗原，形成抗體-抗原-抗體的復(fù)合物直接法ELISA固相抗原將待測抗原固定在固相載體上酶標(biāo)記抗體加入酶標(biāo)記的抗體，與抗原反應(yīng)顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化間接法ELISA固相抗原將待測抗原固定在固相載體上待測抗體加入待測抗體，與抗原反應(yīng)酶標(biāo)記抗抗體加入酶標(biāo)記的抗抗體，與抗體反應(yīng)顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化競爭性ELISA固相抗體將已知濃度的抗體固定在固相載體上待測抗原加入待測抗原與酶標(biāo)記的抗原競爭結(jié)合抗體顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化結(jié)果分析待測抗原濃度與顯色程度呈負(fù)相關(guān)夾心式ELISA固相抗體1將特異性抗體1固定在固相載體上待測抗原加入待測抗原，與抗體1反應(yīng)酶標(biāo)記抗體2加入酶標(biāo)記的抗體2，與抗原反應(yīng)顯色反應(yīng)加入酶底物，觀察顏色變化酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的樣品制備樣品類型血清、血漿、尿液、組織、細(xì)胞等制備方法離心、沉淀、過濾、提取等，去除干擾物質(zhì)注意事項樣品處理要規(guī)范，避免污染，保證樣品質(zhì)量酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的檢測步驟1包被抗原或抗體將待測抗原或抗體固定在固相載體上2封閉用封閉液封閉固相載體上的空位，減少非特異性結(jié)合3加入樣品加入待測樣品，與固相抗原或抗體反應(yīng)4加入酶標(biāo)記抗體加入酶標(biāo)記的抗體，與抗原或抗體反應(yīng)5洗滌洗去未結(jié)合的物質(zhì)6加入底物加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生顏色變化7測定結(jié)果用酶標(biāo)儀或分光光度計測定顏色變化，計算結(jié)果酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的定量分析1標(biāo)準(zhǔn)曲線用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線2樣本測定測定樣本的吸光度值3結(jié)果分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣本中抗原或抗體的濃度酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域臨床診斷傳染病診斷檢測病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體抗體或抗原自身免疫病診斷檢測自身抗體，輔助診斷自身免疫性疾病腫瘤標(biāo)志物檢測檢測腫瘤標(biāo)志物，輔助診斷腫瘤環(huán)境監(jiān)測水質(zhì)檢測檢測水體中的細(xì)菌、病毒、農(nóng)藥殘留等污染物空氣質(zhì)量檢測檢測空氣中的細(xì)菌、病毒、污染物等土壤檢測檢測土壤中的農(nóng)藥殘留、重金屬等污染物食品安全檢測食品添加劑檢測檢測食品中是否添加了違禁添加劑肉類安全檢測檢測肉類中的激素、抗生素等殘留乳制品安全檢測檢測乳制品中的抗生素、農(nóng)藥殘留等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)檢測病蟲害檢測檢測植物病蟲害，及時防治動物疫病檢測檢測動物疫病，預(yù)防疫情爆發(fā)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測檢測農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留、重金屬等，保證食品安全酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的優(yōu)勢和局限性優(yōu)勢靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、成本低廉、應(yīng)用廣泛局限性檢測時間較長，可能受到樣品質(zhì)量、操作因素的影響，某些情況下靈敏度不足靈敏度和特異性靈敏度檢測方法識別陽性樣品的準(zhǔn)確率特異性檢測方法識別陰性樣品的準(zhǔn)確率檢測時間和成本檢測時間傳統(tǒng)ELISA方法需要數(shù)小時，新型ELISA方法可縮短至數(shù)十分鐘成本ELISA方法成本相對較低，適合大規(guī)模檢測操作復(fù)雜性操作步驟ELISA方法操作步驟較多，需要嚴(yán)格的實驗操作人員要求需要具備一定的專業(yè)知識和技能臨床應(yīng)用的局限性交叉反應(yīng)抗體或抗原可能與其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果干擾因素樣品質(zhì)量、操作因素等可能影響檢測結(jié)果靈敏度不足在某些情況下，ELISA方法的靈敏度不足以檢測微量抗原或抗體酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢1新型檢測平臺的開發(fā)微流控芯片、納米材料等新技術(shù)應(yīng)用于ELISA檢測2多重檢測和自動化技術(shù)發(fā)展多重ELISA檢測方法，提高檢測效率3分子診斷與融合技術(shù)ELISA技術(shù)與分子診斷技術(shù)結(jié)合，提高檢測精度和靈敏度新型檢測平臺的開發(fā)微流控芯片將ELISA反應(yīng)縮小到微米尺度，提高檢測效率和靈敏度納米材料納米材料具有高表面積、生物相容性等優(yōu)點，可用于增強(qiáng)ELISA檢測信號多重檢測和自動化技術(shù)多重ELISA檢測在一個反應(yīng)體系中同時檢測多種抗原或抗體自動化技術(shù)開發(fā)自動化ELISA檢測系統(tǒng)，提高檢測速度和準(zhǔn)確性分子診斷與融合技術(shù)PCR技術(shù)將ELISA技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，提高檢測靈敏度基因測序技術(shù)將ELISA技術(shù)與基因測序技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)精準(zhǔn)診斷結(jié)語酶聯(lián)免疫技術(shù)是一種簡單、快速、高效的檢測方法，在醫(yī)學(xué)、生物、食品等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用?？偨Y(jié)本課程內(nèi)容1