生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院《APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制》項(xiàng)目申報(bào)

1項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)項(xiàng)目名稱(chēng)APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及指導(dǎo)教師起止年月21、申請(qǐng)書(shū)所列各項(xiàng)內(nèi)容均須實(shí)事求是填寫(xiě)，表達(dá)明確嚴(yán)謹(jǐn)，簡(jiǎn)明扼要。模板可網(wǎng)上下載、自行加頁(yè)。2、申請(qǐng)書(shū)首頁(yè)只填寫(xiě)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人。"項(xiàng)目編號(hào)"一欄可不填。3、項(xiàng)目負(fù)責(zé)人所在院系須認(rèn)真審核，簽署推薦意見(jiàn)并加蓋公章后3名稱(chēng)APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制所屬學(xué)科學(xué)科一級(jí)門(mén)：理學(xué)生物科學(xué)申請(qǐng)金額起止年月2023年7月至2024年7月負(fù)責(zé)人姓名XX性別男民族漢出生年月2003年5月學(xué)號(hào)聯(lián)系電話(huà)指導(dǎo)教師XX聯(lián)系電話(huà)負(fù)責(zé)人曾經(jīng)參與1.參與基金項(xiàng)目"構(gòu)建3D工程化共培養(yǎng)模型探究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展及藥效評(píng)估”中材料物理性能的檢測(cè)；指導(dǎo)教帥承擔(dān)科1.構(gòu)建3D工程化共培養(yǎng)模型探究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展及藥效評(píng)估，國(guó)家自然科學(xué)基金(青年基金),在研，主持。2.山東省高等學(xué)校青創(chuàng)團(tuán)隊(duì)課題“功能性生物材料開(kāi)發(fā)與類(lèi)器官構(gòu)建及應(yīng)用的研究",在研，主持。3.基于工程化腫瘤模型探究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展機(jī)制，山東省4.基于脫細(xì)胞基質(zhì)肺轉(zhuǎn)移模型中細(xì)胞間及細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用的研究，濰坊醫(yī)學(xué)院博士基金，在研，主持。指導(dǎo)教師對(duì)本項(xiàng)目的支持情況1.指導(dǎo)教師對(duì)本項(xiàng)目中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行指導(dǎo)完善，對(duì)項(xiàng)目書(shū)的撰寫(xiě)進(jìn)2.指導(dǎo)教師在本項(xiàng)目中多糖結(jié)構(gòu)分析、支架的制備、組織工程腫瘤模型的構(gòu)建及生物學(xué)檢測(cè)、藥物活性檢測(cè)等驗(yàn)，可在整個(gè)項(xiàng)目的實(shí)施過(guò)程中進(jìn)行階段、任務(wù)、步驟的規(guī)范和確認(rèn)，保證項(xiàng)目的順利進(jìn)行。3.對(duì)本項(xiàng)目中前期預(yù)實(shí)驗(yàn)需要的試劑及耗材的花費(fèi)以及可能超過(guò)4項(xiàng)目組主要成員學(xué)號(hào)專(zhuān)業(yè)班級(jí)所在學(xué)院項(xiàng)目中的分工2021級(jí)生物制藥生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院多糖生物活性檢測(cè)及模型構(gòu)建2020級(jí)生物制藥生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及數(shù)2022級(jí)生物技術(shù)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院支架性能檢測(cè)及3D模型構(gòu)建2022級(jí)生物技術(shù)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院多糖活性檢測(cè)肺癌的患病率和死亡率均居癌癥前位，臨床治療仍是一大挑戰(zhàn)耐藥性。從天然產(chǎn)物及中草藥中尋找毒性低且療效好的抗腫瘤活性成分成為研究熱轉(zhuǎn)移有抑制作用，對(duì)肺癌患者維持治療具有臨床可行性，使用APS協(xié)同順鉑可顯著改善臨床癥狀。作為腫瘤生物學(xué)研究的工具而言，三維(Three-dimen于此，本研究擬基于脫細(xì)胞豬肺基質(zhì)/明膠支架構(gòu)建體外3D肺癌模型，并進(jìn)一步探究APS協(xié)同順鉑抑制體外抗3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作(1)考察APS和順鉑物理化學(xué)及結(jié)構(gòu)，結(jié)合已有文獻(xiàn)，確定其生物活性發(fā)揮的可能因素；(2)分別制備脫細(xì)胞豬肺基質(zhì)dECM及dECM/明膠復(fù)合支架，對(duì)支架表觀形貌、結(jié)構(gòu)及5察支架上細(xì)胞分布、滲透、生長(zhǎng)增殖情況以評(píng)估構(gòu)建模型的可行性，考察3D模型相比(3)利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對(duì)肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，為APS在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮減毒增效作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為APS臨床應(yīng)用于肺癌患者(a)查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定APS的最佳濃度范圍，通過(guò)SEM、活死染色、CCK及DAPI染色考察APS對(duì)肺癌細(xì)胞株是否具有直接的抑制活性；(b)考察APS聯(lián)合順鉑兩藥對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)考察APS變化，APS糖協(xié)同順鉑是否增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞的促凋亡作用及抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)(a)經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用胰蛋白酶、TritonX-100和SDS結(jié)合對(duì)新鮮的豬肺組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，并使用0.1M鹽酸溶液與胃蛋白酶結(jié)合溶解脫細(xì)胞基質(zhì)，脫細(xì)胞優(yōu)的脫細(xì)胞組合方案。(b)根據(jù)豬肺基質(zhì)脫細(xì)胞過(guò)程膠原及糖胺聚糖的損失情況，確定加入脫細(xì)胞肺基質(zhì)、明膠兩者的質(zhì)量比。根據(jù)人體肺泡結(jié)構(gòu)、孔徑大小和肺臟機(jī)械強(qiáng)度(c)通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)探究不同預(yù)凍溫度、預(yù)凍速率、預(yù)凍時(shí)間對(duì)干燥dECM表觀形貌、孔dECM力學(xué)性能、熱穩(wěn)定性、孔隙率、交聯(lián)度及降解率等物理性能的影響，明確最佳的(d)系統(tǒng)檢測(cè)交聯(lián)后的dECM/明膠用于組織工程模型的理化性能(宏觀及微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率、孔尺寸、吸水率、生物力學(xué)性能);初步確定復(fù)合支6(3)APS協(xié)同順鉑抑制3D培養(yǎng)肺癌生長(zhǎng)的作用及機(jī)制(a)通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定肺癌細(xì)胞-脫細(xì)胞基質(zhì)腫瘤模型用于研究藥物作用的適宜細(xì)胞密度及APS、順鉑體外作用肺癌細(xì)胞的適宜濃度；對(duì)比無(wú)APS干預(yù)組，從其對(duì)免疫細(xì)胞及其細(xì)胞周期的阻滯層面探究APS協(xié)同順鉑抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并考察其抑制機(jī)制。(c)探究APS協(xié)同化順鉑抑制體外3D培養(yǎng)工程化模型中肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及機(jī)制，主要包括干擾細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面。觀察APS聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞細(xì)(四)國(guó)、內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動(dòng)態(tài)肺癌所有病例的80%至85%,近二十年肺癌的發(fā)病率每年以11%左右的速度遞增1]。由藥物治療肺癌已迫在眉睫2。越來(lái)越多的科學(xué)研究表明，來(lái)自天然資源(植物、動(dòng)物和真菌)的多糖在預(yù)防或治療癌癥方面具有廣闊的前景。目前最具代表性的多糖是香菇多糖的抗腫瘤生物活性是通過(guò)直接殺傷腫瘤、增強(qiáng)免疫功能和協(xié)同化療實(shí)現(xiàn)的3。副作用、改善患者身體狀況及延長(zhǎng)生存時(shí)間等polysaccharides,APS)應(yīng)用于臨床且療效顯著,但是大多作為輔助抗癌藥物使用，其抗論依據(jù)，使黃芪多糖更好的在臨床治療中發(fā)揮作用。APS是從黃生物活性成分(圖1A-B),可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)B淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。黃芪多糖的7免疫調(diào)節(jié)作用使其有望用于治療多種疾病，包括癌癥、感染、I型糖尿病、哮喘和自身免疫性疾病。其中，抗癌作用最為突出5。AACacD種藥理作用。目前，黃芪多糖具有開(kāi)發(fā)改善或治療不同疾病的藥物的巨大潛力。更重順鉑(圖1C)是多種惡性腫瘤的臨床常用鉑類(lèi)化療藥物，能破與各種生物分子相互作用。根據(jù)軟硬酸堿(HSAB)理論，PtII是一種軟酸。與HS甘肽等含硫親核試劑以及蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基7。然而，它們反應(yīng)，特別是含氮的供體，如DNA和RNA中的核堿基，蛋白質(zhì)和多肽中的組氨酸殘8性的化療藥物-順鉑，具有普遍的癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)，但是仍然難免有部分肺癌患者仍會(huì)的耐受性及依從性。據(jù)報(bào)道，65-95%的順鉑可在給藥后24小時(shí)內(nèi)與血漿蛋白結(jié)合。剩與順鉑攝取。順鉑引起CRT1濃度的降解，導(dǎo)致癌細(xì)胞順鉑積累降低。CTR1表達(dá)越高的細(xì)胞順鉑積累量越高，對(duì)順鉑的敏感性越高，同時(shí)順鉑也可誘導(dǎo)細(xì)胞膜細(xì)胞凋亡0。前為修復(fù)受損DNA提供了時(shí)間。順鉑激活檢查點(diǎn)激酶Chk1和Chk2,阻滯。取消這些抑制可能導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，迫使癌細(xì)胞在未修復(fù)的DNA損傷面前過(guò)早地重新進(jìn)入細(xì)胞周期，從而通過(guò)NER途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。腫瘤抑制蛋白p53是一種短保持穩(wěn)定性，因此它也被稱(chēng)為“基因組的守護(hù)者”[。敏感性用于腫瘤的治療。在體外實(shí)驗(yàn)中，雖有少部分研究發(fā)現(xiàn)APS可以直接抑制癌細(xì)抑制三維培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制，為黃芪多糖通過(guò)發(fā)揮其抗細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞14]。腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)是低氧、低營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用是通過(guò)整合素調(diào)節(jié)的，從而產(chǎn)生了對(duì)腫瘤的反饋回路。整合素直接與ECM成分相互作用，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供必要的牽引力。9圖2.原發(fā)性腫瘤進(jìn)展和TME內(nèi)復(fù)雜的相互作用[13目前研究癌癥進(jìn)展和抗癌藥物篩選的主要工具是腫瘤模型，現(xiàn)有模型大致分為三類(lèi)：2D細(xì)胞模型、3D模型和動(dòng)物培養(yǎng)模型。截止到目前為止，2D細(xì)胞培養(yǎng)仍然是大多數(shù)腫瘤研究的主要方式，但2D培養(yǎng)缺乏腫瘤在體內(nèi)的微環(huán)境，無(wú)法真實(shí)反映腫瘤在養(yǎng)系統(tǒng)不能反映腫瘤組織的高復(fù)雜性和生物學(xué)特征。因此，細(xì)胞在2D培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)藥|篩選和療效研究中最常用的動(dòng)物模型是皮下移植瘤，它允許復(fù)雜的腫瘤-基質(zhì)細(xì)胞相互立的，腫瘤細(xì)胞被注射到皮膚下6。然而，一個(gè)完整功能免疫系統(tǒng)的缺陷也可能影響腫導(dǎo)，在癌癥相關(guān)研究中是必不可少的。傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型已被證明在解釋癌細(xì)胞行為和解釋可能機(jī)制的假說(shuō)方面是有效的。然而，一種定義良好的3D診斷和治療應(yīng)用中獲得了濃厚的興趣。生物學(xué)研究表明，細(xì)胞在3D建模環(huán)境中可能具和活性[17]。典模式依賴(lài)于生物材料支架、細(xì)胞和生物活性分子的組合來(lái)協(xié)調(diào)組織的形成和在宿主環(huán)境中的整合。組織工程的一個(gè)重要途徑是開(kāi)發(fā)生物材料，通過(guò)有效地運(yùn)輸細(xì)胞群體和治療劑，以及提供賦予組織足夠機(jī)械性能的結(jié)構(gòu)支架來(lái)促進(jìn)再生過(guò)程。隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展，運(yùn)用同樣理念產(chǎn)生的3D組織工程腫瘤技術(shù)受到了眾多關(guān)注，呈現(xiàn)出多樣化發(fā)展趨勢(shì)?；谥Ъ苄纬赡[瘤球的模型中支架材料的使用提高了3D培養(yǎng)模型的多樣性，增加了基質(zhì)的剛度和孔隙率等因素，以模擬某些腫瘤的微環(huán)境，這些物理因素的加入可以改變基因表達(dá)和細(xì)胞信號(hào)傳遞[18。A圖3.細(xì)胞外基質(zhì)主要成分示意圖[19近年來(lái)，組織工程學(xué)的概念逐漸深入到生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，其傳統(tǒng)設(shè)計(jì)方案中基于支架或基質(zhì)材料的3D組織培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠盡可能地接近天然ECM的生物、物理及生化環(huán)境，并通過(guò)各類(lèi)的模塊化組織工程技術(shù)，促進(jìn)其在替代或修復(fù)臨床組織缺損之外的非治療醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。組織工程支架的制備已成為科學(xué)研究熱點(diǎn)，各種各樣的生物材料和一系列的技術(shù)用于制備組織工程支架，用于身體中不同組織和器官的再生。無(wú)論組織的類(lèi)型，支架在設(shè)計(jì)和應(yīng)用時(shí)一些關(guān)鍵的因素是必須被考慮的。細(xì)胞外基質(zhì)不僅在確定肺的三維結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)方面起著重要作用，而且在包括細(xì)胞黏附、分化、生長(zhǎng)和增殖在內(nèi)的各種細(xì)胞活動(dòng)中也起著重要作用。該基質(zhì)由多種結(jié)構(gòu)和功能成分組成，如膠原、層粘連蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白(圖3)。天然ECM中存在的一些關(guān)鍵分子，包括蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子，也是信號(hào)傳遞所必需的19。成功的脫細(xì)胞手術(shù)將消除細(xì)胞成分，同時(shí)保留由膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白組成的肺ECM,并將準(zhǔn)確保留呼吸道和血管復(fù)雜分級(jí)分支結(jié)構(gòu)。隨著脫細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，脫細(xì)胞基質(zhì)廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域并取得重大進(jìn)展(圖4)。與此同時(shí)，科學(xué)家們也積極開(kāi)發(fā)利用脫細(xì)胞基質(zhì)的新的應(yīng)用領(lǐng)域，目前的是，每種支架都有其特定的生化和機(jī)械信號(hào)，進(jìn)而產(chǎn)生不同的細(xì)胞Temperature/Force/PrMesenchymalStemCelMesenchymalStemCel ChemicalNon-lonic/BasesHypCombined&NovelDecellularizationMethods Postprocessing&RecellularizationMe圖4.脫細(xì)胞ECM的制備及其在組織工程的應(yīng)用[20]多糖保護(hù)重要器官免受毒性，還通過(guò)改變自噬或觸發(fā)凋綜上所述，研究APS抗癌機(jī)制有助于為其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。APS具有抗腫瘤的作用，其機(jī)制復(fù)雜，既往的實(shí)驗(yàn)研究表明，APS對(duì)腫瘤細(xì)胞G1期具有阻滯作用，為APS抗腫瘤及協(xié)同化療藥物抗腫瘤研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，APS協(xié)同順鉑抑制了體外3D工程化肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，對(duì)于抗腫瘤的體外研究而言，3D組織工程腫瘤模型可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)2D培養(yǎng)及體內(nèi)動(dòng)物模型的不足，為研究腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)所具有的生化及機(jī)械性能。目前，組織/器官脫細(xì)胞基質(zhì)可極大程度保留原胞外基質(zhì)成分，其優(yōu)越的生物相容性、3D拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能進(jìn)一步改善腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，為后續(xù)組織工程腫瘤構(gòu)建提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?；诿摷?xì)胞基質(zhì)/明膠構(gòu)建的腫瘤模型更加模擬體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，使得APS聯(lián)合鉑類(lèi)藥物對(duì)體外抗癌結(jié)果更加具有[1]周彩存，王潔，王寶成，等.中國(guó)非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療專(zhuān)家共識(shí)(2020年版)[J].中國(guó)肺癌雜志，2021,24(4):217.[2]NagasakaM,GadgeelSnon-smallcelllungcancer[J].Expertreviewofantican[3]RenY,LiS,SongZ,etal.Theregulatoryrolesphytochemicalsinliverdiseases[J].Nutrients,2022,14(11):2303.[4]PandyaU,DhuldhajU,SahayNS.Bioactivemushroompolysaccharidesasantitumor:anoverview[J].Naturalproductresearch,2019,33(18):2668-2680.[5]LiW,SongK,WangS,etal.AnC,2019,98:685-695.[6]ZhengY,RenW,ZhangL,etal.AreviewofthepharmacologicalactionofAstragaluspolysaccharide[J].FrontiersinPharmacology,2020,11:349.[7]SunCY,ZhangQY,ZhengGJ,cancercellstocisplatin[J].Biomedic[8]QiL,LuoQ,ZhangY,etal.Advancesintoxicologicalresearchofthcisplatin[J].Chemicalresearchintoxicology,2019,32(8):1469-1486.[9]WangL,ZhaoX,FuJ,etal.TheroleoftumourmetabolismFrontiersinmolecularbiosciences,2021,8:691795.[10]曲萌.自噬性細(xì)胞死亡在順鉑與ATR抑制劑聯(lián)合所致有絲分裂災(zāi)難中的作用研[11]liYangY,wenLinZ,tingHeP,etal.InhibitoryeffectofAstragalusPolysacchari[J].BiologicalandPharmaceuticalBu[12]方星辰，?？〔?，汲晨鋒.基于天然多糖構(gòu)建納米藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中[13]deVisserKE,JoyceJA.Theevolvingtumormicroenvironment:Frtometastaticoutgrowth[J].CancerCell,2023,41(3):374-403.[15]KechagiaJZ,IvaskaJ,Roca-CusachsP.Integrinsasmicroenvironment[J].NatureReviewsMolecula[16]JungJ,SeolHS,ChangS.Thegenerationandapplicationofpatient-derivedxmodelforcancerresearch[J].Cancerresearchandtreatment:officialjournalofKoreanCancerAssociation,2018,50(1):1-10.[17]張寧.仿生細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控和應(yīng)用[D].東南大學(xué)，2018,19(6):1764-1782.engineeringtissueandorgan-specificmicroenvironmentstrendsandemergingstrategiesintissueen[21]ChakrabortyJ,RoyS,GhoshS.Regulationofdecellularizedmaresponse[J].Biomaterialsscience,2020,8(5):1194-1215.[22]DeshpandeNU,JayakannanM.Cisplatin-stitchedpolysasynergisticcancertherapyoftripleantagonisticdrugs[J].Biomacromolecules,2017,18(1sensitivity/resistancetocisplatinchemotherapy:roleofmicro[J].Cellularsignalling,2021,78:109871.(五)創(chuàng)新點(diǎn)與項(xiàng)目特色(1)通過(guò)體外考察APS協(xié)同順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株的抑制作用，APS可以多靶點(diǎn)作用，參與整體調(diào)控，具有改善或逆轉(zhuǎn)耐藥的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)使用中草藥APS來(lái)減輕順鉑造成的各類(lèi)毒性，提高抗癌活性。(3)著眼于基礎(chǔ)到轉(zhuǎn)化研究，通過(guò)體外3D肺癌肺轉(zhuǎn)移工程化模型評(píng)估APS協(xié)同順鉑抑制肺癌生長(zhǎng)的作用及機(jī)制，為APS用于臨床化療輔助治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本項(xiàng)目總體技術(shù)路線如圖5所示：APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制細(xì)胞是否有抑制作用結(jié)構(gòu)成分分析材料投入比例巨噬細(xì)<脫細(xì)胞肺基質(zhì)dECM/明膠復(fù)合支架的制備dECM/明膠溶液交聯(lián)后凍干成型性是否滿(mǎn)足要求生長(zhǎng)作用機(jī)制APS抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制肺癌細(xì)胞接種質(zhì)結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能確定最優(yōu)比例的dECM/明膠復(fù)合支架養(yǎng)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用3D工程化肺癌模型構(gòu)建及細(xì)胞行為分析順鉑APS協(xié)同順鉑抑制體外三維工程化肺癌發(fā)(定植生長(zhǎng)及遷移)的作用及機(jī)制蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制分析圖5.本項(xiàng)目總體技術(shù)路線之一。3D肺癌組織工程模型探究APS聯(lián)合化療藥物減毒增效的抗腫效果及其作用機(jī)制，為APS輔助肺癌臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)是本項(xiàng)目要解決的另一關(guān)鍵問(wèn)題。(3)預(yù)期成果代物。同時(shí)，我們希望利用此3D工程化腫瘤模型探究APS協(xié)同順鉑體外抑制肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，為APS臨床用于肺癌輔助治療提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)；為APS在肺癌們也希望此模型用于評(píng)估其它臨床前抗肺癌藥物的治療效果。具體成果預(yù)期有如下幾末，減少批次差異性，最大限度降低因APS結(jié)構(gòu)及組成的不同對(duì)后續(xù)其生物活性的影(2)保證高脫細(xì)胞效率前提下，減小豬源性肺組織基質(zhì)成分的損失，制備盡可能保行為及對(duì)化療藥物敏感性等證明組織工程3D腫瘤模型用于研究肺癌生物學(xué)行為及作為(4)通過(guò)3D腫瘤模型探究APS協(xié)同順鉑抑制肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移作用及機(jī)制，明確APS提高化療藥物療效，為APS輔助肺癌臨床治療提供更多實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。期刊或核心期刊發(fā)表論文1篇，申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利1項(xiàng)。(七)項(xiàng)目研究進(jìn)度安排量、純度、微觀結(jié)構(gòu)、分子量及單糖組成等理化性質(zhì)的檢測(cè)手段；熟悉APS在抗腫瘤用效果，確定合適的脫細(xì)胞方案，制備脫細(xì)胞肺基質(zhì)/明膠支架并對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)、支架孔徑、孔隙率、吸水率、機(jī)械性能等進(jìn)行多種物理性能檢測(cè)解順鉑耐藥和多器官毒性背后的分子機(jī)制，聯(lián)合中藥成分APS減輕其毒性，充分發(fā)揮死活染色、CCK、免疫熒光等檢測(cè)手段考察細(xì)胞在支架粘附、滲透、活性、生長(zhǎng)增殖情況，評(píng)估復(fù)合支架的生物相容性及構(gòu)建的腫瘤模型作為藥物篩選平臺(tái)的可行性，總?cè)旧?、常?guī)組織學(xué)檢測(cè)等手段考察APS協(xié)同順鉑對(duì)三維培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的影響，并考察其抑制機(jī)制。探究APS協(xié)同化療藥物抑制體外3D培養(yǎng)工程化模型中(八)已有基礎(chǔ)項(xiàng)目成員由1名指導(dǎo)教師、1名大三、1名大二及2名大一學(xué)生組成，均從屬于生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，涉及生物技術(shù)、生物制藥及生物醫(yī)學(xué)工程專(zhuān)業(yè)。(1)學(xué)生方面：學(xué)開(kāi)具備一定的專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)和科學(xué)思維能力。同時(shí)，自入學(xué)析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，以上均為本項(xiàng)目(2)指導(dǎo)教師方面：指導(dǎo)教師近年來(lái)從事干細(xì)胞與組織工程、生物材料和抗腫瘤等目指導(dǎo)教師主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金1項(xiàng)，主持山東省青創(chuàng)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目1項(xiàng)和山東省青年基金1項(xiàng)，主持濰坊醫(yī)學(xué)院博士基金項(xiàng)目1項(xiàng)，參與2項(xiàng)國(guó)家科學(xué)自然基金面上|前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)制備過(guò)豬源性脫細(xì)胞肺基質(zhì)dECM且考察單純肺基質(zhì)的生物相容性及細(xì)胞在支架的分布及滲透情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞在dECM培養(yǎng)第3天，細(xì)胞之間相互連接且增殖形成腫瘤球。第7天，支架表面及內(nèi)部腫瘤球隨處可見(jiàn)。第14天，腫瘤球尺寸明顯增大，且與周?chē)[瘤球進(jìn)一步相連。培養(yǎng)至21天，由于與相鄰集落的相孔壁(橙色箭頭)及骨架(藍(lán)色箭頭)上的粘附和伸展(圖6B)。構(gòu)建物的Hoechst染色像進(jìn)行不同程度旋轉(zhuǎn)呈現(xiàn)了細(xì)胞在支架的分布(圖6B,I-II)。A標(biāo)記死細(xì)胞數(shù)逐漸增多且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。1FU作用后細(xì)胞內(nèi)5-FU處理組腫瘤球數(shù)量和尺寸低于未加藥組。加藥5天后，CM實(shí)驗(yàn)組仍能觀察到很多胞活率分別是83.46±2.6%和79.04±2.43%。然而，5-FU作用3天后細(xì)胞活率明顯降低。加藥5天后，盡管CM進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但是其作用效果明顯低于5-FU組(圖7B)。05-A5A5給藥后細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高。相比未處理組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞F-actin表達(dá)并沒(méi)有明顯區(qū)別，但是5-FU給藥后F-actin熒光強(qiáng)度顯著下調(diào)。此外，DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM(1000μg/mLAPS)和5-FU給藥3天后，部分細(xì)胞出現(xiàn)從支架脫落的現(xiàn)象。APS(1000μg/mL)介導(dǎo)CM組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)略微下調(diào)，但是5-Bcl-2表達(dá)顯著下降(P<0.05)。CM和5-FU干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)明顯升高(圖8C)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，給藥處理2天時(shí)，CM組雖然提高Bax/Bcl-2的并無(wú)顯著性差異。加藥處理4天后，CM組Bax/Bcl-2的比值顯著提高(P<0.05),但其比值仍明顯低于5-FU作用組(圖8D)。CC22圖8.APS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞上清促進(jìn)細(xì)胞凋亡機(jī)制備，已裝備倒置和正置熒光顯微鏡、CCD攝像裝置以及Imageplus圖象分析軟件、紅流式細(xì)胞儀、動(dòng)物活體化學(xué)發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)、DNA/RNA合成儀、數(shù)碼凝膠圖器。另外，學(xué)校具有豐富的國(guó)內(nèi)外紙質(zhì)版和電子版文獻(xiàn)資料，方便項(xiàng)目成員進(jìn)行查閱，無(wú)。開(kāi)支科目預(yù)算經(jīng)費(fèi)(元)主要用途階段下達(dá)經(jīng)費(fèi)計(jì)劃(元)前半階段用于項(xiàng)目所需試劑、1.業(yè)務(wù)費(fèi)測(cè)試費(fèi)和版面費(fèi)(1)計(jì)算、分析、測(cè)試費(fèi)用于激光共聚焦顯微鏡和SEM測(cè)試費(fèi)(2)能源動(dòng)力費(fèi)(3)會(huì)議、差旅費(fèi)(4)文獻(xiàn)檢索費(fèi)(5)論文出版費(fèi)論文版面費(fèi)2.儀器設(shè)備購(gòu)置費(fèi)3.實(shí)驗(yàn)裝置試制費(fèi)4.材料費(fèi)模型及生物學(xué)檢測(cè)所需的耗材及試劑學(xué)校批準(zhǔn)經(jīng)費(fèi)本項(xiàng)目利用體外3D工程化肺癌模型探究黃芪多糖協(xié)同化療藥物順鉑發(fā)揮抗導(dǎo)和支持，確保項(xiàng)目的順利完成。導(dǎo)師(簽章):203年5月了日同意年月日山東省高等學(xué)校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目項(xiàng)目編號(hào)項(xiàng)目名稱(chēng)APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用XX項(xiàng)目級(jí)別國(guó)家級(jí)(√)按計(jì)劃進(jìn)行、()進(jìn)度提前、()進(jìn)度滯后(起止時(shí)間)項(xiàng)目研究成果(已取得的成果)項(xiàng)目成果名稱(chēng)中藥單體抗腫瘤應(yīng)用基礎(chǔ)與臨床前景論文(在投)2論文(在投)二、項(xiàng)目季度報(bào)告(項(xiàng)目執(zhí)行的進(jìn)展情況，取得了哪些成績(jī)，是否達(dá)到預(yù)期效果，以及在項(xiàng)目的開(kāi)展過(guò)程中還存在哪些問(wèn)題。)本項(xiàng)目執(zhí)行開(kāi)始日期為2023年7月，項(xiàng)目持續(xù)時(shí)間為2023.07-2024.0過(guò)去3個(gè)月，目前在進(jìn)行支架的制備以及對(duì)支架形態(tài)進(jìn)復(fù)合支架的制備材料。具體的技術(shù)路線圖呈現(xiàn)如下：APS20請(qǐng)的p.德是兩有同卜四成分分析E加的基即JECW30工程化弱焰橫型構(gòu)調(diào)盟交聯(lián)及各No(定植生長(zhǎng)及遷移)的作用及機(jī)制滿(mǎn)APS協(xié)同睡的制體外30工程化所事生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)AP5的高及那船細(xì)田(定植生長(zhǎng)及遷移)的作用及機(jī)否結(jié)束制腳應(yīng)婦的是否有和制用e2長(zhǎng)的作性長(zhǎng)作用前期預(yù)實(shí)驗(yàn)嘗試過(guò)脫細(xì)胞肺基質(zhì)/明膠復(fù)合支架的制備，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想，因而對(duì)實(shí)驗(yàn)方案及技術(shù)路線進(jìn)行了調(diào)整。目前正在進(jìn)行的部分具體過(guò)程及結(jié)果如下：第一批支架的制備：使用聚乙二醇、絲膠蛋白、殼聚糖三種材料進(jìn)行復(fù)合支架的制備：殼聚糖(CS)聚乙二醇(PEG)絲膠蛋白(SS)總濃度按照上述濃度配置50ml體系的溶液，分別稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的藥品，先將稱(chēng)取好的絲膠蛋白、后充分?jǐn)嚢枞芙?。攪拌溶解后，取出轉(zhuǎn)子，進(jìn)行超聲除泡，該步驟循環(huán)兩到三次，待氣泡充分從溶液中揮發(fā)出來(lái)后，用小藥匙或者移液槍將氣泡除去。最后將溶液進(jìn)行加板，分別在24孔板上做好標(biāo)記，將除泡后的混合溶液加入到孔板中，注意加入過(guò)程中不能出現(xiàn)氣泡。加板完成干燥后所得支架如圖3A所示，第一組支架從孔板中取出時(shí)發(fā)現(xiàn)支架出現(xiàn)明顯的掉屑的現(xiàn)象(圖3B),說(shuō)明該組支架的藥品濃度或配比不適宜。對(duì)三組支架切下上下表面加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)浴鍋中貼上封口膜進(jìn)行攪拌溶解所得混合溶液為交聯(lián)劑。隨后將支架加入交聯(lián)劑后室溫交聯(lián)12h。交聯(lián)12h后對(duì)支架進(jìn)行水洗，將三組支架分別放入水中后，觀察到前兩組的支架出現(xiàn)部分溶解的現(xiàn)象(圖3C)。說(shuō)明這兩組支架配比或濃度不適宜。第三組支架形態(tài)完好，因而對(duì)其進(jìn)行水洗(圖3D),將該組支架放置于調(diào)速多用振蕩器上，將轉(zhuǎn)速設(shè)置為130并在此轉(zhuǎn)速下震蕩30min,以便充分洗去支架中的交聯(lián)劑。之后將支架再次預(yù)凍12h后，冷凍干燥24h,得到最終的支架。第二批支架的制備：使用明膠和絲膠蛋白進(jìn)行支架的制備：絲膠蛋白(SS)明膠(Gel)通過(guò)上述步驟對(duì)支架進(jìn)行制備。一次冷凍干燥后，5%和6%復(fù)合支架均出現(xiàn)中空現(xiàn)象，4%復(fù)合支架部分出現(xiàn)中空，部分形態(tài)保持良好，因而只對(duì)4%復(fù)合支架中形態(tài)完好的支架進(jìn)行后續(xù)處理。用刀片小心切除支架上表面后使用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，結(jié)果觀察到支架形態(tài)發(fā)生明顯變結(jié)果可觀察到支架部分凹陷且斷裂嚴(yán)重，經(jīng)過(guò)查找文獻(xiàn)得知，明膠和絲膠蛋白具有強(qiáng)親水性，支架材料中缺少非親水性的材料且原本的交聯(lián)試劑作用效果并不理想，從而導(dǎo)致支架形態(tài)無(wú)法維持，出現(xiàn)中部裂開(kāi)的現(xiàn)象。第三批支架的制備：通過(guò)總結(jié)前兩批支架出現(xiàn)的問(wèn)題結(jié)合文獻(xiàn)的查閱，改用海藻酸鈉、明膠、絲膠蛋白作為復(fù)合支架的制備材料。明膠(Gel)海藻酸鈉(SA)絲膠蛋白(SS)按照上述濃度配置50ml體系的混合溶液，分別稱(chēng)取相應(yīng)的藥品(圖7A),將稱(chēng)取好的藥品加入37℃水浴鍋中攪拌溶解。待藥品完全溶解后對(duì)混合溶液進(jìn)行超聲除泡(圖7B)。由于混合溶液過(guò)于粘稠，將液體除泡之后放在37℃水浴鍋中進(jìn)行慢速旋轉(zhuǎn)過(guò)夜處理(圖7C),以便使混合溶液中的氣泡充分排出。溶液氣泡完全排出后將混合溶液進(jìn)行加板，加入24孔板后，進(jìn)行預(yù)凍和冷凍干燥處理，最終得到支架如圖8。由圖可以看出，所制備的海藻酸鈉/明膠/絲膠蛋白支架為微黃色多孔結(jié)構(gòu)，三個(gè)比例的支架宏觀無(wú)明顯區(qū)別。之后將加入氯化鈣和EDCNHS進(jìn)行交聯(lián)及二次凍干處理，考察此次制備的復(fù)合支架方案是否可行。如果滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求，將進(jìn)一步對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行孔隙率、吸水率、微觀結(jié)構(gòu)、紅外、機(jī)械強(qiáng)度等物理性能的考察。同時(shí)，對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行體內(nèi)外生物相容性的檢測(cè)。圖8.Gel/SA/SS復(fù)合支架一次凍干后形貌已使用項(xiàng)目研究經(jīng)費(fèi)：2500元已報(bào)銷(xiāo)金額：1500_元未報(bào)銷(xiāo)金額：1000元項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)開(kāi)支情況備注論文版面費(fèi)專(zhuān)利申請(qǐng)費(fèi)調(diào)研、差旅費(fèi)打印、復(fù)印費(fèi)相關(guān)文件打印資料費(fèi)試劑等耗材費(fèi)其它五、指導(dǎo)教師意見(jiàn)：(包括項(xiàng)目的組織實(shí)施、進(jìn)度、預(yù)期效果、經(jīng)費(fèi)使用等情況)2023年11月28日季度檢查結(jié)果類(lèi)別限期整改不合格濰坊醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目編APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制XX項(xiàng)目級(jí)別國(guó)家級(jí)項(xiàng)目進(jìn)展情況(√)按計(jì)劃進(jìn)行、()進(jìn)度提前、()進(jìn)度滯后主要研究階段(起止時(shí)間)研究?jī)?nèi)容完成情況制備工程化肺癌模型中ECM替代物完成項(xiàng)目研究成果(已取得的成果)序號(hào)項(xiàng)目成果名稱(chēng)成果形式1中藥單體抗腫瘤應(yīng)用基礎(chǔ)與臨床前景論文(在投)2論文(在投)二、項(xiàng)目中期報(bào)告(項(xiàng)目執(zhí)行的進(jìn)展情況，取得了哪些成績(jī)，是否達(dá)到預(yù)期效果，以及在項(xiàng)目的開(kāi)展過(guò)程中還存在哪些問(wèn)題，3000字以?xún)?nèi))本項(xiàng)目執(zhí)行開(kāi)始日期為2023.07,項(xiàng)目持續(xù)時(shí)間為2023.07-2024.07,為期1年，目前過(guò)去一半時(shí)間，已經(jīng)完成了前期復(fù)合支架的制備、支架相關(guān)的物理性能檢測(cè)以及HE染色評(píng)估A549結(jié)構(gòu)明膠/海藻明膠/海藻養(yǎng)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用細(xì)胞上清CM細(xì)胞是否有抑制作用肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用機(jī)制用機(jī)制巨噬細(xì)的制備及EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(接),癌)EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(種),細(xì))EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(肺),胞) 材料投入比例 明膠/海藻酸鈉/絲膠蛋白溶液交聯(lián)后凍干比例的明膠/海藻酸鈉/是否滿(mǎn)意Yes結(jié)束圖1.本項(xiàng)目總體技術(shù)路線及已完成部分通過(guò)總結(jié)前期對(duì)支架制備過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題以及查閱文獻(xiàn)，最后選取了海藻酸鈉、明膠、和力學(xué)性能檢測(cè)等。具體過(guò)程及結(jié)果如下：1.復(fù)合支架的制備稱(chēng)取三組質(zhì)量分別為0.25g、0.5g、0.75g的絲膠蛋白，三組質(zhì)量為0質(zhì)量為1g的海藻酸鈉，加入到50mL純水中，加入轉(zhuǎn)子，放入40℃水浴鍋中并持續(xù)攪拌，使其完全溶解，制備成絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉混合溶液。取出轉(zhuǎn)子，將混合溶液置于超聲機(jī)中超聲3次，每次20min,以便使混合溶液中的氣泡溢出。每次超聲后用移液槍吸去混合溶液中漂浮在表面的氣泡，超聲后在攪拌器上慢速攪拌過(guò)夜保證去除所有氣24孔板中并置于-20℃冰箱中預(yù)凍過(guò)夜后，將其放入冷凍干燥機(jī)(冷井溫度：-80℃)中干燥28h,獲得總濃度為3.5%、4%、4.5%的絲膠蛋白-明膠-海藻酸鈉復(fù)合支架。經(jīng)過(guò)干燥后的復(fù)合支架肉眼觀察為淡黃色多孔結(jié)構(gòu)，且隨著濃度增大，孔愈發(fā)致密。將孔板內(nèi)的支架取出，用刀片盡量薄的切去比較粗糙的兩面。先向每個(gè)的氯化鈣(氯化鈣與海藻酸鈉濃度比為1:1)溶液靜置交聯(lián)3h后，吸去每個(gè)孔內(nèi)的氯化鈣溶液，然后根據(jù)支架數(shù)量確定所需交聯(lián)劑的總體積，配置100mL乙醇濃度為80%的交聯(lián)劑。取一個(gè)燒杯，加入乙醇和水，將稱(chēng)量好的EDC、NHS、MES依次緩慢加入，加入轉(zhuǎn)子，放入攪拌器中在37℃的條件下攪拌均勻。混勻后，向每個(gè)孔中加入2mL80%乙醇溶解的EDC(1-(3-二藥品物質(zhì)的量濃度c為50mmol/L,m=n*M=c*v*M。靜置交聯(lián)12h,吸去交聯(lián)劑。隨后對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行水洗。分別將三組濃度的復(fù)合支架轉(zhuǎn)移至300mL燒杯中，放入震蕩機(jī)中，用純水清洗30min。將清洗后的復(fù)合支架放入4℃的冰箱中預(yù)凍12h后，再放入冷凍干C2.復(fù)合支架的物理性能檢測(cè)將干燥后絲膠蛋白濃度分別為0.5%、1%和1.5%復(fù)合支架切成薄片(6*6*1mm),置于倒置顯微鏡下觀察支架的微觀形貌。進(jìn)一步地利用ImageJ軟件對(duì)每組支架進(jìn)行孔徑分度為1%時(shí)，支架孔徑在201.1±7.1lμm左右，絲膠蛋白濃度為2%時(shí)，支架孔徑約為 0圖3.復(fù)合支架的孔徑檢測(cè)2.2.絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架吸水率檢測(cè)將干燥的復(fù)合支架切成長(zhǎng)方體結(jié)構(gòu)，盡量使各試支架的干重，用m1表示，置于24孔板中，加入PBS溶液室溫浸泡3h后紙將支架表面的水進(jìn)行擦拭，稱(chēng)取其重量記錄為m2。每種材料測(cè)試多組取角平整。稱(chēng)量復(fù)合邊,平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié) 0圖4.復(fù)合支架的吸水率檢測(cè)支架的吸水能力對(duì)細(xì)胞輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物至關(guān)重要。圖4為不同濃是由于復(fù)合支架中2.3.絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架力學(xué)性能檢測(cè)將干燥后的支架切成長(zhǎng)方體，確保表面高度整齊，使用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)復(fù)合支架的力學(xué)架變形量與總長(zhǎng)度的比值，ε=(l-x)/l;其中y為壓力負(fù)荷，單位為N;a,b,1分別為支架的長(zhǎng)、 0圖5.復(fù)合支架力學(xué)性能檢測(cè)3.HE染色評(píng)估A549細(xì)胞增殖及其形態(tài)待復(fù)蘇后的A549細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中達(dá)到90%的融合后，加入胰酶進(jìn)行消化后，1000rpm離心5min,倒掉上清液，加入1mL完全培養(yǎng)基吹打混勻后，進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)濃度稀釋后，取50μL細(xì)胞懸浮液(2×103個(gè))加入24孔板中培養(yǎng)5天，通過(guò)HE染色考察細(xì)HE分析：待A549細(xì)胞在孔板分別培養(yǎng)1d,3d和5d后，將培養(yǎng)基吸出，加入4%多聚甲醛固定15min后，用PBS沖洗2次。之后，加入200μL蘇木精染液染色20min,PBS洗去浮色。加入分化液分化10s,PBS浸洗2次。加入200μL伊紅染液染色2min,PBS清洗2次后，由HE染色結(jié)果可知，培養(yǎng)一天后，細(xì)胞均已粘附于孔板底部，細(xì)胞良好伸展，多數(shù)細(xì)胞為鱗狀，細(xì)胞方向各異(圖6)。放大倍數(shù)下，HE的細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)良好的鋪展。角形或多角形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞密度增多，待細(xì)胞培養(yǎng)5天后，細(xì)胞之間相互連接，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)在孔板達(dá)到90%以上融合，HE染色顯示有些區(qū)域細(xì)胞方向錯(cuò)以上結(jié)果明確了1%復(fù)合支架可以作為后期體外三維肺癌模型的支架材料，其在成分、孔作用。目前實(shí)驗(yàn)開(kāi)展順利，較好的達(dá)到了預(yù)的多種細(xì)胞生物學(xué)行為(粘附、分布、形態(tài)、滲透、活性、增殖等)并利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對(duì)肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。已使用項(xiàng)目研究經(jīng)費(fèi)：4800元項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)開(kāi)支情況用途金額備注論文版面費(fèi)專(zhuān)利申請(qǐng)費(fèi)調(diào)研、差旅費(fèi)打印、復(fù)印費(fèi)資料費(fèi)試劑等耗材費(fèi)用于購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞、支架材料及生物學(xué)檢測(cè)所需的耗材及試劑硬件購(gòu)置費(fèi)其它肺癌細(xì)胞在復(fù)合支架中多種細(xì)胞行為的檢測(cè)(粘附、分布、形態(tài)、滲透、活性、增殖等),復(fù)合支架生物相容性實(shí)驗(yàn)研究及利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對(duì)肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。該項(xiàng)目實(shí)施方案設(shè)計(jì)合理，實(shí)驗(yàn)進(jìn)度按照前期安排穩(wěn)定進(jìn)行，且取得了較好經(jīng)費(fèi)使用合理，項(xiàng)目組成員團(tuán)隊(duì)合作能力較好，實(shí)驗(yàn)同意√限期整改山東第二醫(yī)科大學(xué)APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制XX項(xiàng)目級(jí)別國(guó)家級(jí)項(xiàng)目進(jìn)展情況主要研究階段(起止時(shí)間)研究?jī)?nèi)容完成情況構(gòu)建體外肺癌模型并考察肺癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為完成項(xiàng)目研究成果(已取得的成果)序號(hào)項(xiàng)目成果名稱(chēng)成果形式1山東省大學(xué)生醫(yī)藥生物技術(shù)技能大賽(創(chuàng)新大賽)-山東省一等獎(jiǎng)競(jìng)賽獲獎(jiǎng)2競(jìng)賽獲獎(jiǎng)的開(kāi)展過(guò)程中還存在哪些問(wèn)題。)本項(xiàng)目執(zhí)行開(kāi)始日期為2023.07,項(xiàng)目持續(xù)時(shí)間為2023.07-2024.07,為期1年，目前已經(jīng)制備了絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架，并對(duì)其進(jìn)行了多項(xiàng)物理性能，進(jìn)一步地接種肺癌細(xì)胞構(gòu)建3D肺癌模型并確定其可行后，加入APS和順鉑考察藥物抑制肺癌細(xì)胞的作用。具體這幾個(gè)月的實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果展開(kāi)如下：將復(fù)合支架切成薄片后浸于75%乙醇溶液中并放置在紫外燈下滅菌過(guò)夜。將滅菌好的支架從六孔板中取出，用PBS清洗兩遍以洗去殘留的酒精，隨后將支架放入24孔板內(nèi)，并將24孔板置于超凈臺(tái)內(nèi)開(kāi)啟吹風(fēng)至支架三分之二干燥。將肺癌細(xì)胞A549用PBS清洗2次后，加入2mL胰酶進(jìn)行消化，之后加入4mL完全培養(yǎng)基終止消化，將消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1000rpm離心5min。對(duì)離心后的細(xì)胞進(jìn)行重懸，將細(xì)胞懸浮液加入到2mLEP管中，吹打均勻后，吸取100μL滴入血球計(jì)數(shù)板中，用顯微鏡對(duì)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)區(qū)進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成補(bǔ)加100μL培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱孵育4h后，每孔補(bǔ)加1mL培養(yǎng)基至液體基本覆蓋每孔的底將A549細(xì)胞接種到1%的絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架上培養(yǎng)1d、3d、5d和7d后，使用Calcein-AM染色和HE組織學(xué)分析評(píng)估細(xì)胞在支架的增殖。將A549細(xì)胞接種到1%絲膠箱中孵育30min后，置于激光共聚焦下拍照，使用激光共聚焦序列掃描考察肺癌細(xì)胞在復(fù)合多個(gè)腫瘤球后，加入以上不同濃度的藥物進(jìn)行處理，待培養(yǎng)2天后，移去原培養(yǎng)基和藥物，每入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min后，使用PBS溶液沖洗2次后，置于激光共聚焦下拍照，考察不同給藥處理對(duì)3D肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。待肺癌模型構(gòu)建成功，加入上述不同給藥組進(jìn)行孵育48h后，PBS沖洗3次，2.5%戊二醛固定3h,加入梯度酒精(50%,70%,90%,100%)逐級(jí)脫水，每次脫水30min,室溫下自然干燥后，用導(dǎo)電膠將細(xì)胞-支架構(gòu)建物粘于載物臺(tái)進(jìn)行噴金60s,置于鎢燈絲掃描電鏡下拍照，通過(guò)給藥后細(xì)胞形態(tài)的變化考察APS-CM及每孔加入20μLCCK-8和200μL基培混合液，在培養(yǎng)箱孵育3h后，使用移液槍吹打細(xì)胞-支架復(fù)合物，每孔吸取100μL混合液至96孔板中，于酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度OD值，通過(guò)每組的OD值和存活率評(píng)估不同給藥處理對(duì)3D肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1肺癌細(xì)胞在絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架的生長(zhǎng)增殖鈣黃綠素和HE切片結(jié)果顯示細(xì)胞接種1天后，絕大部分細(xì)胞在復(fù)合支架骨架及表面貼壁且鋪展；培養(yǎng)3天后，細(xì)胞沿支架骨架及孔隙呈良好伸展，支架結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，到第5天的時(shí)候，大部分細(xì)胞開(kāi)始收縮且細(xì)胞間堆疊形成大小不一的集落，細(xì)胞間連接非常緊密；培養(yǎng)7天后，細(xì)胞集落進(jìn)一步增大，遍布整個(gè)復(fù)合支架(圖1)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸生長(zhǎng)增殖且絕大多數(shù)活細(xì)胞被鈣黃綠素染色呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光均表明支架良好的生物相容性，且支架具有較好的多孔結(jié)構(gòu)，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物傳質(zhì)的進(jìn)行，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了良好的增殖空間。2.2APS協(xié)同順鉑對(duì)三維肺癌細(xì)胞的抑制作用死活染色結(jié)果如圖2所示，空白對(duì)照組在支架形成了多個(gè)細(xì)胞集落且連接成片，絕大部分活在支架的分布。經(jīng)給藥處理肝癌細(xì)胞2d后，不同給藥組均表現(xiàn)出不同程度的殺傷作用，鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記的活細(xì)胞數(shù)逐漸減少，被PI染成紅色的壞死細(xì)胞數(shù)逐漸增多。另外，從Hoechst染色也可看出APS和順鉑單獨(dú)作用組的細(xì)胞毒性作用弱于兩者的協(xié)同效果，聯(lián)合給藥組多數(shù)細(xì)胞集落逐漸松散且外層細(xì)胞逐漸溶解，細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少，多數(shù)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，被PI著色，僅有少量狀態(tài)不佳的小細(xì)胞集落及細(xì)胞殘片。以上結(jié)果表明APS和順鉑均具有細(xì)胞毒作用，兩者協(xié)同ControlSEM觀察APS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞上清CM和順鉑對(duì)3D肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(圖3A)。給藥第2天，空白對(duì)照組能清楚看到緊密堆疊密的細(xì)胞集落，集落之間相互連接成片，細(xì)胞狀態(tài)良好。單獨(dú)的APS和順鉑組的外層細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生一定改變，部分出現(xiàn)凋亡小體現(xiàn)象(藍(lán)色箭頭),且相比未處理組細(xì)胞集落尺寸明顯減小(橙色虛框)。聯(lián)合給藥組細(xì)胞集落逐漸分CCK-8定量考察單獨(dú)APS、順鉑及兩者聯(lián)合給藥對(duì)3D肝癌細(xì)胞的作用效果(圖2B-C)。給藥處理一天后，APS單獨(dú)給藥和順鉑組細(xì)胞活性區(qū)別并不顯著,細(xì)胞活率均高于85%以上。給藥2天后，給藥組細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，細(xì)胞活率明顯下降。加藥3天后，盡管單獨(dú)給藥進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但是其作用效果明顯低于聯(lián)合給藥組(p<0.001)。以上結(jié)果表明，APS介導(dǎo)AAControlAPS-100B圖3.APS和順鉑對(duì)三維肺癌細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的影響(C)APS和順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞活率的影響已使用項(xiàng)目研究經(jīng)費(fèi)：21000元已報(bào)銷(xiāo)金額：21000元項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)開(kāi)支情況用途備注論文版面費(fèi)專(zhuān)利申請(qǐng)費(fèi)調(diào)研、差旅費(fèi)打印、復(fù)印費(fèi)資料費(fèi)試劑等耗材費(fèi)其它四、項(xiàng)目后期具體工作計(jì)劃項(xiàng)目已完成同意季度檢查結(jié)果類(lèi)別限期整改生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制項(xiàng)目級(jí)別國(guó)家級(jí)項(xiàng)目起始時(shí)間：2023年7月計(jì)劃完成時(shí)間：2024年6月實(shí)際完成時(shí)間：2024年6月項(xiàng)目負(fù)責(zé)人及成員姓名學(xué)號(hào)XX多糖生物活性檢測(cè)及姚偉杰生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析馮子慧支架性能檢測(cè)及3D模型構(gòu)建高曉晨多糖活性檢測(cè)姓名XX副教授項(xiàng)目指導(dǎo)與資助講師項(xiàng)目指導(dǎo)一、項(xiàng)目實(shí)施情況(請(qǐng)就研究目標(biāo)、研究過(guò)程、研究成果、研以?xún)?nèi)):(1)考察APS和順鉑物理化學(xué)及結(jié)構(gòu)，結(jié)合已有文獻(xiàn)，確定其生物活性發(fā)揮的可能因素；考察APS是否具有直接抗肺癌活性。(2)分別制備脫細(xì)胞豬肺基質(zhì)dECM及dECM/明膠復(fù)合支架，對(duì)支架表觀形貌、結(jié)構(gòu)及組成、孔隙率、吸水率、機(jī)械性能及熱穩(wěn)定性等物理性能進(jìn)行表征；接種肺癌細(xì)胞并考察支架上細(xì)胞分布、滲透、生長(zhǎng)增殖情況以評(píng)估構(gòu)建模型的可行性，考察3D模型相比2D腫瘤模型藥物篩選的準(zhǔn)確性。(3)利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對(duì)肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，為APS在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮減毒增效作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為APS臨床應(yīng)用于肺癌患者(1)APS協(xié)同順鉑對(duì)2D肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(a)查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定APS的最佳濃度范圍，通過(guò)SEM、活死染色、CCK及DAPI(b)考察APS聯(lián)合順鉑兩藥對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)考察APS作用后細(xì)胞周期的變化，順鉑作用后細(xì)胞周期的變化，還有兩藥的聯(lián)合出現(xiàn)細(xì)胞周期的變并對(duì)支架形態(tài)進(jìn)行觀察、對(duì)支架進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試。但制備出的復(fù)合支架在用鑷子夾取時(shí)后改用明膠和絲膠蛋白，但由于這兩種支架材料的親水性過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致原本選用的交聯(lián)試劑達(dá)不到理想的交聯(lián)效果，制備出的支架凍干成型性和機(jī)械強(qiáng)度都不理想；經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)和多次實(shí)驗(yàn)，確定制備方案為：使用絲膠蛋白(0.5%、1%、1.5%)、海藻酸鈉(2%)、明膠(1%)作為復(fù)合支架的制備材料。.孔徑大小、吸水率等的影響，界定最優(yōu)的冷凍干燥參數(shù)。通過(guò)探究不同交聯(lián)劑對(duì)復(fù)合支架生物力學(xué)性能);初步確定復(fù)合支架的細(xì)胞及組織生物相容性，具體包括肺癌細(xì)胞在復(fù)合(3)APS協(xié)同順鉑抑制3D培養(yǎng)肺癌生長(zhǎng)的作用及機(jī)制(a)通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定肺癌細(xì)胞-脫細(xì)胞基質(zhì)腫瘤模型用于研究藥物作用的適宜細(xì)胞密度及APS、順鉑體外作用肺癌細(xì)胞的適宜濃度；對(duì)比無(wú)APS干預(yù)組，從其對(duì)免疫細(xì)胞及其細(xì)胞周期的阻滯層面探究APS協(xié)同順鉑抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。(b)明確APS、順鉑濃度及細(xì)胞合適的接種量后，構(gòu)建腫瘤模型。通過(guò)活死染色、CCK、SEM、DAPI染色、AV/PI試劑盒、常規(guī)組織學(xué)檢測(cè)等手段考察APS聯(lián)合順鉑對(duì)三維培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并考察其抑包括干擾細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面。觀察APS聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞細(xì)采用氯化鈣離子交聯(lián)和EDC/NHS共價(jià)交聯(lián)并二次冷凍干燥后得鈉/明膠復(fù)合支架呈現(xiàn)多孔聯(lián)通結(jié)構(gòu)，0.5%和1%復(fù)合支架大孔套小孔復(fù)合支架的孔(圖1A)。隨著絲膠蛋白濃度的提高，復(fù)合支架孔徑逐漸減少，支架總體的孔徑均在170-280μm之間(圖1B)。支架的吸水能力對(duì)細(xì)胞輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物至關(guān)重復(fù)合支架的壓縮模量逐漸增大，且各組均具有顯著性差異(圖1D)。所制備的絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架具有良好的力學(xué)性能，能夠支持后續(xù)細(xì)胞的生長(zhǎng)增CBD圖1.絲膠蛋白/海藻酸鈉/明膠復(fù)合支架的物理性能分析(A)通過(guò)SEM考察復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)；(B)復(fù)合支架的孔徑分析；(C)復(fù)合支架的吸水率檢測(cè)；(D鈣黃綠素和HE切片結(jié)果顯示