HIV檢測及臨床意義

HIV檢測及臨床意義中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院艾滋病確認試驗室尚紅——HIV的發(fā)現(xiàn)Montagnie(LAS)1983.Science220:868-871Gallo(HTLV)1983.Science220:865-86Levy(ARV)1984.Science225:840-842

1986國際病毒分類委員會：HIVHIV-21986

西非中國每年新發(fā)現(xiàn)的HIV/AIDS

病例數(shù)（1985~）2HIV感染可通過兩種途徑檢測直接檢測病毒或其構(gòu)成部分檢測人體HIV免疫反應(yīng)——HIV特異性抗體從感染到血清抗體陽轉(zhuǎn)有一段窗口期，平均為1-3個月，有一小部分HIV感染者出現(xiàn)延遲反應(yīng)HIV感染后抗原和抗體的變化

及其與疾病關(guān)系HIV感染人體后出現(xiàn)一過性病毒血癥，6-8周后血清抗體陽轉(zhuǎn)，病毒滴度減少，在隨即的5-8年無癥狀帶毒期里HIV抗體一直存在，但病毒難查到。進入AIDS期后血漿中病毒再次出現(xiàn)。故診斷HIV感染多數(shù)時間用抗體檢測診斷，極初期（窗口期）用抗原檢測。HIV抗體診斷 目前臨床上實際應(yīng)用的是測定特異性HIV抗體，包括初篩和確認試驗。一、檢測試劑篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經(jīng)國家藥物監(jiān)督管理局注冊同意、批批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其他迅速診斷試劑。采供血機構(gòu)進行血液篩查應(yīng)采用酶聯(lián)免疫試劑。自采自供血的單位必須進行HIV抗體檢測，在尚未建立艾滋病篩查試驗室的偏遠地區(qū)可由通過培訓(xùn)的技術(shù)人員在規(guī)定的場所用迅速試劑進行血液篩查。62、確認試劑必須經(jīng)國家藥物監(jiān)督管理局注冊同意。確認試劑包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗及免疫熒光試驗試劑。目前以免疫印跡試劑最為常用。ELISA措施： 目前最常用的初篩試驗，自1985年初次檢測HIV-1抗體的試劑盒供市以來，已從第一代的全病毒抗原間接法發(fā)展到第四代的以重組的多肽抗原及抗P24抗體包被的雙夾心法，使窗口期縮短了2-3周。四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗體HIV-1-IgG抗體第二代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗體HIV-1/-2IgG抗體第三代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-O病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗體Closingthewindow<infectivity=>4thgen3rdgen=>

=>1st-2ndgenHIVantigenIgMabIgGabDetectionlimit<=window第一代試劑檢測IgG抗體，第三代試劑檢測IgG、IgM抗體,第四代試劑同步檢測IgG、IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。檢測成果的匯報和處理陰性反應(yīng)出具HIV抗體陰性匯報，假如近期有高危行為，如性亂、注射毒品等，或有急性流感樣癥狀等狀況，為排除“窗口期”的也許，可以進行HIV-1P24抗原或HIV核酸檢測，或2－3個月后來再做抗體檢測。篩查試驗呈陽性發(fā)現(xiàn)反應(yīng)，可出具“HIV抗體待復(fù)查”的匯報，不能出陽性匯報。樣本初篩檢測一陰一陽均陽性反應(yīng)陰性報告送確認重復(fù)檢測陰性報告均陰性反應(yīng)陽性反應(yīng)原有試劑＋另一種原理初篩試劑選用初篩試劑陰性反應(yīng)HIV抗體初篩檢測流程圖迅速診斷試劑：采用乳膠凝集、免疫斑點和免疫層析三種原理迅速、不需特殊儀器敏感度、特異度低于ELISA，且價格貴合用于血站覆蓋不到的邊遠地區(qū)/都市大醫(yī)院急診手術(shù)前檢查迅速診斷陽性成果還需經(jīng)ELISA措施驗證HIV抗體確認常用確實認試驗措施是免疫印跡法（WB）。免疫印跡試劑有HIV-1/2混合型和單一型。一般先用HIV-1/2混合型試劑進行檢測蛋白印跡試驗（WB） ——廣泛使用確實認試驗用聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的HIV蛋白抗原分開后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。標(biāo)本中存在的HIV抗體與條帶上的抗原結(jié)合，再加入酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，在抗原抗體結(jié)合的部位會出既有色條帶其可檢測標(biāo)本中針對HIV不一樣抗原的抗體，故被用做確認試劑。不一樣的研究機構(gòu)有不一樣的鑒定原則WB成果鑒定原則組織陽性陰性WHO2ENV+GAG+POL無條帶或只有P17FDA（USA）1ENV+p24/p31無條帶CHINA２ENV或１ENV+p24無HIV-1特異性條帶“不確定”(±)：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型局限性以 確認陽性，每三個月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性HIV-1抗體特異帶HIV-2抗體特異帶envgp160/gp120gp41gp140/gp105、gp36，也可為gp125/gp80、gp36gagp55、p24、p17（或p18）p56、p26、p16polp66（或p65）、p51、p31p68、p53、p34

HIV抗體確認檢測流程圖免疫印跡法(HIV1/2混合型)HIV-1陽性反應(yīng)可疑反應(yīng)出現(xiàn)HIV-2指帶HIV-1陽性匯報可疑反應(yīng)陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)匯報HIV-2血清學(xué)陽性反應(yīng)匯報必要時測核酸陰性匯報免疫印跡法（HIV-2）每3個月隨訪一次，共2次，仍屬可疑，則作陰性匯報如隨訪期間出現(xiàn)陽性反應(yīng)則匯報陽性陰性反應(yīng)陰性匯報

P24抗原測定（一）合用范圍HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。HIV-1陽性母親所生嬰兒的鑒別診斷。第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應(yīng)，但HIV-1抗體確認陰性者的診斷。監(jiān)測病程進展和抗病毒治療效果。（三）成果匯報和解釋

1、HIV-1P24抗原的陽性成果必須通過中和試驗確認。2、HIV-1P24抗原陽性僅作為HIV感染的輔助診斷根據(jù)，不能依此確診。3、HIV-1P24抗原陰性成果只表達在本試驗中無反應(yīng)，不能排除HIV感染。HIV核酸檢測

1、輔助診斷某些非經(jīng)典的抗體反應(yīng)，尤其是不確定反應(yīng)時，RNA的測定可提供非常有用的證據(jù)。單純使用RNA測定不能完全確定感染與否，但當(dāng)RNA測定出現(xiàn)較高拷貝數(shù)的陽性成果時（>1000）提醒感染發(fā)生的也許性非常大。使用此指標(biāo)應(yīng)綜合其他檢測數(shù)據(jù)和樣品背景狀況進行綜合分析與判斷。222、窗口期輔助診斷在窗口期抗原峰出現(xiàn)前后一般出現(xiàn)一種病毒載量的高峰，一般此高峰高于發(fā)病時的血漿病毒水平，初期病毒RNA測定具有特殊的意義。目前國際上正在嘗試使用這種檢測對采供血樣品進行多種樣品混合后的RNA檢測以減少窗口期傳播的殘存危險度。3、病程監(jiān)控由于HIV感染發(fā)生后病毒載量的變化具有一定規(guī)律，并且這種變化與疾病的進程有著親密的有關(guān)性。一般在感染后無癥狀期內(nèi)發(fā)生的臨床癥狀很難與AIDS發(fā)病時的癥狀區(qū)別，病毒載量測定可以協(xié)助醫(yī)生判斷一種剛發(fā)生的癥狀與否與HIV感染有關(guān)。4、指導(dǎo)治療方案及療效測定并非在任何狀況下感染者都應(yīng)當(dāng)進行抗病毒治療，這不僅是經(jīng)濟上的原因，更重要的是在于抗病毒藥物的副作用和療效。一般在病毒載量到達一定水平后（如>35000-50000拷貝/毫升）才具有良好的效果。只有通過治療后病毒水平的檢測才能確定治療與否有效，一般治療后病毒水平減少50%才被認為臨床有效。通過監(jiān)測病毒滴度反應(yīng)療效255、預(yù)測疾病進程HIV疾病進程與病毒載量的關(guān)系十分親密，觀測感染者病毒RNA水平可大體預(yù)測其發(fā)病的也許。如右圖所示，病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系為：<500時5.4%，501-3000時16.6%，3001-10000時31.7%，10001-30000時55.2%，>30000時則為80%。26定性檢測HIV核酸檢測有定性和定量兩類，定性檢測用于HIV感染的輔助診斷。一般使用PCR或RT-PCR技術(shù)，使用分子生物學(xué)試驗室通用的擴增試劑，引物可來自文獻或自行設(shè)計，應(yīng)盡量涵蓋所有的或常見的毒株，也可使用復(fù)合引物。27

定量檢測定量檢測常用于監(jiān)測HIV感染者的病程進展和抗病毒治療效果。目前常用的HIVRNA定量測定措施有逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗（RT-PCR）、核酸序列擴增試驗（NASBA）、分支DNA雜交試驗（bDNA）等，這幾種進口試劑盒的最低檢測限為20-50拷貝/毫升按照儀器讀數(shù)匯報成果，應(yīng)注明使用的試驗措施、樣品種類和樣品量。測定成果不不小于最低檢測限時，應(yīng)注明最低檢測限水平。注意低于最低檢測限的成果不能排除HIV感染。應(yīng)附上儀器打印的數(shù)據(jù)。28

RocheBayer(前Chiron)Organon技術(shù)RT-PCRbDNANuclisensHIV-1QT結(jié)果比較約2xbDNA2.02.0版結(jié)果約為RT-PCR的50%，3.0版結(jié)果與Roche基本相同與Roche基本相同優(yōu)點通過了FDA認證假陽性結(jié)果較bDNA少1.5版對A-G亞型有較好的反應(yīng)性操作時間較少對A-G亞型有較好的反應(yīng)性通過了FDA認證可使用多種組織，如生殖道分泌液對A-G亞型有較好的反應(yīng)性檢測范圍大缺點操作容易污染測定范圍較小（相對于NASBA）少數(shù)生物樣品反應(yīng)受抑制，如精液、乳汁和唾液早期版本對部分亞型反應(yīng)性較差，1.0版對非B亞型的樣品反應(yīng)性普遍較差，（5）版通過改進對O亞型檢測能力較差對低值樣品檢測的特異性較差。無內(nèi)部質(zhì)量控制，尤其在3.0版中為單孔檢測時，無法控制由于提取或加樣操作的失誤。不同版本間差異較大，2.0版約為RT-PCR50%，3.0版結(jié)果與Roche基本相同表明兩個版本間差異可能達到50%。對除血漿、血清外的大部分體液樣品無法進行檢測。對抗凝劑敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）對部分亞型（G亞型）反應(yīng)性差。操作復(fù)雜，樣品提取(不使用自動提取儀時)和測定反應(yīng)時需要進行大量的手工操作。不適合一次大量檢測，ECL讀數(shù)儀每次只能進行12個樣品的檢測。實驗內(nèi)、外誤差相對較大。檢測范圍標(biāo)準(zhǔn)版(Amplicor1.0及1.5)

400-750,000c/mL超敏版(Ultra-Direct1.0and1.5):

50-75,000c/mLbDNA3.0版:100-500,000c/mLNuclisensHIV-1QT:40-10,000,000

c/mL(取決于樣品量)多種HIV定量檢測措施的比較有關(guān)不一樣HIV定量檢測措施的選擇目前用于統(tǒng)一不一樣定量措施檢測值的原則品還沒有問世不一樣定量措施成果之間還無法直接比較同一病人治療前后提議用同一措施進行HIV定量檢測艾滋病免疫指標(biāo)的檢測

伴隨政府加速對國產(chǎn)抗艾滋病藥物上市的同意，我國艾滋病人的治療已經(jīng)出現(xiàn)了曙光。艾滋病臨床治療中多種免疫指標(biāo)(CD4+、CD8+T細胞等)對于確定感染狀態(tài)、預(yù)測發(fā)病、評價藥物療效及新藥開發(fā)具有重要的作用。CD4T淋巴細胞：（流式細胞術(shù)） CD4T細胞是HIV的重要靶細胞,感染后伴隨病程進展，CD4T細胞不停下降 <500/mm3——有臨床診斷意義 <200/mm3——AIDS[CDC]病程進展，AIDS診斷和療效觀測的指標(biāo)HIV感染幾周內(nèi)，出現(xiàn)類流感癥狀，也稱為血清陽轉(zhuǎn)期，CD4細胞的數(shù)量減少。隨之出現(xiàn)的免疫應(yīng)答可以控制急性癥狀，恢復(fù)CD4細胞的數(shù)量，但并不能清除病毒。伴隨CD4細胞不停下降，當(dāng)降至500/ul左右時，開始出現(xiàn)機會性感染或其他疾病，進入癥狀期。當(dāng)CD4低于200/ul時，即進入艾滋病期。CD4+T淋巴細胞不不小于350/ul（結(jié)合病毒載量，確定治療時機）有效治療8周后CD4+T淋巴細胞數(shù)量增加50/ulHAART無效CD4+T細胞數(shù)量下降CD4+T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫功能逐漸喪失C