第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段2025/1/21第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段

在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)過(guò)程中，需要采用很多方法和手段。下面就幾種常用的檢驗(yàn)方法作一些基本介紹。一、顯微鏡檢驗(yàn)在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，為了能夠發(fā)現(xiàn)微生物或觀察其形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)，必須借助于顯微鏡。顯微鏡觀察的微生物標(biāo)本一般分為兩種：染色標(biāo)本和不染色標(biāo)本。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（一）不染色標(biāo)本的檢驗(yàn)在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)不染色標(biāo)本是為了觀察微生物細(xì)胞在生活時(shí)期原有的形態(tài)、大小及確定細(xì)胞能否運(yùn)動(dòng)等。不染色標(biāo)本的基本制片方法有以下兩種：1、壓滴法在載波片上加一滴生理鹽水，再在其中滴加少許要觀察的含菌液體或少量要觀察的固體培養(yǎng)物，使菌體均勻分布在生理鹽水中，然后蓋上蓋玻片，即可進(jìn)行鏡檢。2、懸滴法將待觀察的含菌液體滴在蓋玻片上，然后將其反扣在凹玻片上，使液滴懸掛在凹室內(nèi)。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（二）染色標(biāo)本的檢驗(yàn)染色標(biāo)本是將檢驗(yàn)標(biāo)本根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康模匆欢ǖ姆椒ㄍ科潭?，用適當(dāng)?shù)娜玖先旧傻臉?biāo)本。經(jīng)過(guò)染色，微生物細(xì)胞與其背景的色差增加，鏡檢時(shí)更加清晰可見(jiàn)。染色標(biāo)本除能顯示微生物的形態(tài)、排列和一定的構(gòu)造外，還能顯示某些細(xì)胞成分的性質(zhì)及其分布的位置、區(qū)別活菌與死菌、鑒定微生物的種類(lèi)。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段革蘭氏染色法第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段革蘭氏染色法盧戈氏碘液媒染1min95%乙醇脫色20-30s番紅花紅復(fù)染1-2min第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段革蘭氏染色法呈現(xiàn)第一次染色效果-紫色，革蘭氏染色陽(yáng)性菌呈現(xiàn)第二次染色的效果-紅色革蘭氏染色陰性菌第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段二、培養(yǎng)檢驗(yàn)在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，分離培養(yǎng)是一項(xiàng)非常重要的工作，它對(duì)進(jìn)一步確定微生物的種類(lèi)和研究它們的特性等都具有重要意義。微生物的接種和培養(yǎng)

接種工具有：接種針、環(huán)、鉤、玻璃涂棒、接種圈、接種鋤、小解剖刀

1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段A劃線(xiàn)接種：是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線(xiàn)形的移動(dòng)就可達(dá)到接種的目的。常用的接種工具是接種環(huán)、接種針。劃線(xiàn)接種是在斜面接種和平板劃線(xiàn)中常用的方法。

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段B三點(diǎn)接種（點(diǎn)植法）：

在研究霉菌的形態(tài)時(shí)常用此法。它是把少量的微生物接種在平板表面成等邊三角形的三點(diǎn)上，讓它各自獨(dú)立形成菌落來(lái)觀察研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，還有一點(diǎn)或多點(diǎn)接種的。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段C穿刺法接種：

在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常用此法。所用工具是接種針，培養(yǎng)基是半固體培養(yǎng)基。具體做法：用接種針蘸取少量菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線(xiàn)穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線(xiàn)周?chē)軌蛏L(zhǎng)。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段D澆混接種（傾注法）：

是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后倒入冷卻至45左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到了稀釋的目的。待平板凝固后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)生物菌落。E涂布接種（涂布法）：與傾注法略有不同,即先倒好平板，讓其凝固，然后將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液分布均勻，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段

F液體接種：

從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，到入液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中都可稱(chēng)液體接種。

G注射接種：

是用注射的方法，將待接的微生物轉(zhuǎn)至活的生物體內(nèi)如人或其他動(dòng)物中，常見(jiàn)的是疫苗預(yù)防接種，來(lái)預(yù)防某些疾病。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段H活體接種：

是專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)病毒或其他病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。活體可以是整個(gè)動(dòng)物也可以是某個(gè)離體的活組織如猴腎，也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，根據(jù)被檢材料的不同和檢驗(yàn)步驟中的要求不同，在同一種培養(yǎng)基上可以有不同的接種方法。在進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定時(shí)，用的是傾注法接種，再進(jìn)行各種被檢微生物得分離時(shí)，常采用劃線(xiàn)法接種，雖然他們用的都是瓊脂平板，但接種方法各異。食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中常用的接種方法有涂布法、劃線(xiàn)法、傾注法、定植法、穿刺法。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段傾注平板法第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）微生物的培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為

好氧培養(yǎng)：這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則不能生長(zhǎng)良好，實(shí)驗(yàn)是中斜面培養(yǎng)是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過(guò)搖床震蕩，使外界的空氣源源不斷的進(jìn)入瓶中。

厭氧培養(yǎng)：這類(lèi)微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，最重要的一定是要除去培養(yǎng)基中的氧氣?？刹捎靡韵路椒ǔパ鯕狻５谒恼率称肺⑸餀z驗(yàn)方法手段（1）降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：

常將還原劑谷胱甘肽，硫基酸鹽等，加如到培養(yǎng)基中，即可達(dá)到目的，有的將一些動(dòng)物死的或活的組織如牛心羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長(zhǎng)。（2）化合去氧法：

主要有焦性沒(méi)食酸吸收氧氣，用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧菌混合培養(yǎng)吸收氧氣，用植物的組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣，用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（3）隔絕阻氧：

深層液體培養(yǎng)，用石蠟油封存，半固體穿刺培養(yǎng)（4）替代驅(qū)氧：

用CO2驅(qū)代氧，用氮?dú)怛?qū)代氧，用真空驅(qū)代氧，用氫氣驅(qū)代氧，用混合氣體驅(qū)代氧第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段2．培養(yǎng)結(jié)果的觀察各種微生物經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，表現(xiàn)出一定特征，這在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，是鑒別微生物種類(lèi)的重要依據(jù)。（1）固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征的觀察細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)，即可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落，每種細(xì)菌都有一定的菌落形態(tài)和特征，主要包括菌落的大小、形狀、邊緣形態(tài)、顏色、透明度等觀察菌落的形態(tài)特征，通常先用肉眼觀察，再用放大鏡仔細(xì)觀察，必要時(shí)可用低倍鏡觀察。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)特征的觀察主要是液體的渾濁度是否產(chǎn)生沉淀，液體表面有無(wú)菌膜形成，有無(wú)附著菌環(huán)，培養(yǎng)液的顏色以及是否產(chǎn)氣等。（3）半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)特征的觀察主要是其是否需氧及其運(yùn)動(dòng)情況，是在上部還是在下部深層生長(zhǎng)，是沿穿刺線(xiàn)生長(zhǎng)還是樹(shù)根樣生長(zhǎng)。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（三）生化實(shí)驗(yàn)

各種微生物含有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，用于進(jìn)行代謝活動(dòng)，在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的產(chǎn)物也有各自的特點(diǎn)，可借此區(qū)別和鑒定微生物的種類(lèi)。利用這種特點(diǎn)可鑒別微生物。生化試驗(yàn)或生化反應(yīng)是通過(guò)利用生物化學(xué)的方法來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來(lái)鑒別細(xì)菌的類(lèi)別、屬種的試驗(yàn)。

在進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用純培養(yǎng)，嚴(yán)禁其他種類(lèi)的微生物污染，否則會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果，生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目很多，應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康倪m當(dāng)選擇。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段1.糖醇類(lèi)代謝試驗(yàn)此類(lèi)實(shí)驗(yàn)主要用于觀察微生物對(duì)某些糖類(lèi)分解的能力以及不同的分解產(chǎn)物，從而進(jìn)行微生物的鑒定，常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)有以下幾種（1）糖醇類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)

不同的微生物可對(duì)各種糖類(lèi)、醇類(lèi)等進(jìn)行分解，但不同的微生物的分解能力和產(chǎn)物都不相同，如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖（產(chǎn)酸產(chǎn)氣），沙門(mén)氏菌只分解葡萄糖不能分解乳糖（只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）。根據(jù)這一特點(diǎn)，在進(jìn)行大腸菌群測(cè)定時(shí)，可采用乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的溴甲酚紫指示劑由藍(lán)紫色變?yōu)辄S色。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）甲基紅實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锶绱竽c桿菌、志賀氏菌等，在糖代謝過(guò)程中能分解葡萄糖產(chǎn)生多種有機(jī)酸，酸類(lèi)增多會(huì)使培養(yǎng)物的濃度增大。當(dāng)培養(yǎng)基的PH低于4.5時(shí)，甲基紅指示劑是紅色（陽(yáng)性反應(yīng)）；有些細(xì)菌產(chǎn)酸量少，培養(yǎng)基的PH保持在6.2以上，指示劑呈現(xiàn)黃色（陰性反應(yīng)）第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（3）V-P試驗(yàn)?zāi)承┪⑸锬芊纸馄咸烟钱a(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氣氧化生成二乙酰，在萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中所含的胍基成分作用生成紅色化合物，即V-P試驗(yàn)陽(yáng)性。

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段1.糖醇類(lèi)代謝試驗(yàn)（4）七葉苷水解試驗(yàn)原理：七葉苷被細(xì)菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細(xì)菌。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。結(jié)果觀察與記錄（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏?，為?yáng)性，記錄為+（2）培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄-

（三）生化實(shí)驗(yàn)第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段七葉苷水解試驗(yàn)單增李斯特氏菌陽(yáng)性第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（5）B-半乳糖苷酶試驗(yàn)有些微生物在含有乳糖或B-半乳糖苷化合物的存在下，產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，這種酶具有活力，經(jīng)一系列反應(yīng)，使培養(yǎng)物變成深黃色。

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段2、蛋白質(zhì)及氨基酸代謝試驗(yàn)（1）靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)?zāi)承┪⑸锶绱竽c桿菌、變形桿菌、霍亂弧菌等，含有色氨酸酶，能使培養(yǎng)基中色氨酸水解脫氨生成吲哚，吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的玫瑰吲哚而是紅色，即吲哚試驗(yàn)的陽(yáng)性反應(yīng)。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)（沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)）某些微生物如沙門(mén)氏菌、變形桿菌、枯草桿菌、酵母菌等能水解蛋白質(zhì)中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與二價(jià)鐵離子或鉛離子生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段2－志賀氏菌3－沙門(mén)氏菌4－大腸桿菌第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（3）尿素酶檢驗(yàn)（沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)）某些微生物如普通變形桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、奇異變形桿菌屬、沙門(mén)氏菌的個(gè)別變種能產(chǎn)生尿素酶，分解培養(yǎng)基的尿素而產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基變成堿性，最終粉紅色指示劑（酚紅）變?yōu)榧t色。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（4）氨基酸脫羧酶試驗(yàn)（沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)）某些微生物如沙門(mén)氏菌屬含有氨基酸脫羧酶，使氨基酸脫羧產(chǎn)生胺類(lèi)和二氧化碳。胺類(lèi)的存在使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性而使指示劑變色（溴甲酚紫陽(yáng)性紫色，陰性黃色，陰性者無(wú)堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變成黃色）。常用于脫羧酶試驗(yàn)的氨基酸有鳥(niǎo)氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸。（5）苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)?zāi)承┪⑸锞哂斜奖彼崦摪泵福軐⒈奖彼嵫趸摪毙纬杀奖?。苯丙酮酸遇到三氯化鐵成藍(lán)綠色。本試驗(yàn)可用于多種微生物的鑒定。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（6）明膠液化試驗(yàn)

某些微生物能分泌明膠（一種動(dòng)物蛋白）水解酶（蛋白質(zhì)）而水解明膠，使經(jīng)培養(yǎng)后的明膠培養(yǎng)基有原來(lái)的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。3.呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)（1）硝酸鹽還原試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽或氨或氮等。當(dāng)加入格里斯試劑后，亞硝酸鹽與乙酸反應(yīng)生成亞硝酸。亞硝酸與對(duì)氨基苯磺酸作用形成偶氮苯磺酸，偶氮苯磺酸與α-萘胺結(jié)合形成紅色的偶氮化合物N-α-荼氨偶氮苯黃酸，即為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性反應(yīng)的原因有兩個(gè)：一是細(xì)菌不能還原硝酸鹽，則培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽的存在；二是細(xì)菌將亞硝酸鹽還原為氮或氨等物質(zhì)，則培養(yǎng)基中沒(méi)有硝酸鹽的存在。

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段硝酸鹽還原試驗(yàn)操作步驟：接種硝酸鹽肉湯，35℃培養(yǎng)5天，加入0.2ml的試劑A,再加入0.2ml的試劑B,輕搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色者表明有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽(yáng)性。若無(wú)顏色變化，須加入少量鋅粉變紅者為陰性（硝酸鹽未被還原）不變?yōu)殛?yáng)性（亞硝酸鹽已分解成氨和氮）第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)分子氧和細(xì)胞色素C，能氧化鹽酸二甲基對(duì)苯二胺，并和α-萘酚結(jié)合，生成吲哚酚藍(lán)（靛酚藍(lán)），是藍(lán)色反應(yīng)。（3）過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶又稱(chēng)接觸酶，能將水分解而釋放氧氣，大多數(shù)好氧或兼性厭氧微生物能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶,一般厭氧微生物不產(chǎn)生此酶（如乳酸細(xì)菌）第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段

觸酶試驗(yàn)左側(cè)陽(yáng)性,右測(cè)為陰性對(duì)照第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段4.有機(jī)酸鹽和氨鹽利用試驗(yàn)（1）檸檬酸鹽利用試驗(yàn)?zāi)承┪⑸铮óa(chǎn)氣桿菌）能利用氨鹽作為唯一氮源，同時(shí)利用檸檬酸鹽作為唯一碳源。他們可在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并分解檸檬酸鈉而生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑溴百里酚藍(lán)，由原來(lái)的草綠色變?yōu)樗{(lán)色。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）丙二酸鹽利用試驗(yàn)琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中一個(gè)重要環(huán)節(jié)。丙二酸與琥珀酸會(huì)競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸脫氫酶，在丙二酸濃度較高的情況下，琥珀酸脫氫酶不能被釋放出來(lái)催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，從而抑制了三羧酸循環(huán)反應(yīng)進(jìn)行，微生物的生長(zhǎng)也受到了抑制，也有些微生物在丙二酸鈉培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，溴百里酚藍(lán)，由原來(lái)的草綠色變?yōu)樗{(lán)色，說(shuō)明這些微生物能夠利用丙二酸鹽。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段

5.毒性酶試驗(yàn)（1）卵磷脂酶試驗(yàn)有些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，即X-毒素，在有鈣離子存在時(shí)，能迅速分解卵磷脂，生成脂肪和水溶性磷酸膽堿，當(dāng)這些微生物在卵黃胰胨培養(yǎng)液中生長(zhǎng)時(shí)，可出現(xiàn)白色沉淀（脂肪）。第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（2）血漿凝固酶試驗(yàn)

致病性葡萄球菌（金黃葡萄球菌）能產(chǎn)生血漿凝固酶，他們可直接作用于血漿中的纖維蛋白，也可作用于血漿凝固酶原，是之成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固，這是鑒定致病球菌的重要指標(biāo),是否是致病球菌主要看它是否產(chǎn)生凝固酶.有凝塊均勻混濁均勻混濁生理鹽水第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段（3）鏈激酶試驗(yàn)

A型溶血鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶（溶解纖維蛋白酶），該酶能激活人體血液中的血漿蛋白酶原，形成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。在檢驗(yàn)溶血