HIFU的免疫調(diào)控作用

高能量聚焦超聲（HIFU）的免疫調(diào)控機理聚焦超聲是一種正在受到世界各國廣泛重視的無創(chuàng)局部治療手段HIFU：High-IntensityFocusedUltrasoundHIFU技術的產(chǎn)業(yè)轉化：涉及物理學、生物學、醫(yī)學、機械工程學、電子學、計算機科學、材料科學以及傳熱學等多種學科，融合了包括傳感器技術、信號處理技術、水處理技術、生物工程技術、圖像處理、腫瘤組織變性鑒別技術及計算機輔助設計、計算機治療計劃系統(tǒng)等最新研究成果。HIFU作為腫瘤治療的新技術尤其引起了越來越多的關注國內(nèi)外對HIFU已進行了近十年的研究，技術日漸成熟，并已開始從動物試驗向臨床過渡。歐美已批準用于前列腺癌治療。國內(nèi)開展HIFU臨床試驗的研究早于國外，迄今已積累上萬例臨床病例。用于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤治療。

尚待解決的問題：原位復發(fā)：體積較大的實體瘤組織特性和熱傳導性不均一。已有報道軟組織肉瘤的HIFU治療臨床研究中有20%的原位復發(fā)率。腫瘤轉移：已有幾項研究報道HIFU治療并不增加腫瘤轉移的危險腫瘤轉移仍然是病人死亡的主要原因研究熱點：HIFU劑量學即超聲劑量與治療效應的關系、腫瘤影像學與治療過程的實時跟蹤監(jiān)控及組織內(nèi)的精確測溫技術等方面。HIFU除可以殺滅原發(fā)灶腫瘤組織外，還可以增加機體的系統(tǒng)性抗腫瘤免疫

HIFU治療小鼠體表Brown-Pierce肉瘤，當將其原位瘤破壞后其播散結節(jié)也自行消失。HIFU治療荷神經(jīng)母細胞瘤1300小鼠，治愈者再次接種同種腫瘤的腫瘤增殖率降低。腫瘤病人經(jīng)HIFU治療后，循環(huán)中CD3+CD4+T細胞數(shù)量及CD4+/CD8+T細胞數(shù)量比有所上升。HIFU治療乳腺癌使同側腋窩淋巴結內(nèi)濾泡增多，生發(fā)中心擴大，淋巴細胞數(shù)量明顯增多，78%的病例淋巴結為混合免疫反應增強型。

對HIFU調(diào)控免疫應答的作用機制及其潛能缺乏必要的深入研究?？鼓[瘤免疫應答及DC的作用：HIFU增強抗腫瘤免疫的關鍵環(huán)節(jié)可能在于DC的活化和功能調(diào)節(jié)危險理論和危險信號：1994年Matzinger首先提出。認為誘發(fā)機體免疫應答的關鍵因素是機體細胞受損后產(chǎn)生危險信號。核心是接受APCs在免疫應答中的重要地位，認為APCs由損傷的細胞提供的危險信號所激活。危險信號：外源性內(nèi)源性誘導性表達組成性表達腫瘤細胞可以產(chǎn)生并釋放多種內(nèi)源性DC激活因子熱休克蛋白HSPsATP、GTP、mRNA、DNA及其代謝代謝產(chǎn)物UricＡcid等。核蛋白如HMBG1(HighMobilityGroupB1)正常情況下這些分子位于細胞內(nèi)，但在損傷情況下可以釋放至細胞外，激活DC。我們的工作假說：HIFU-treatmentreleaseofcytoplasmcomponentsactivationofDCs

Whatwewanttoknow:HowmuchcytoplasmcomponentscanbereleasedfromHIFU-treatedtumorcellsWhetherthereleasedcytoplasmcomponentscanactivateDCsWhethertheHIFU-triggeredDCactivationcanbreakdowntheimmunetolerancepromoteT-celltoactKillingoftumorcellHIFU實驗系統(tǒng)：超聲的熱效應調(diào)整超聲的聲場參數(shù)可獲得不同特點的溫度變化曲線。

HIFU能對腫瘤組織內(nèi)0.3～1mm范圍升溫至70℃以上而鄰近2mm范圍內(nèi)則迅速降溫至50℃以下。HIFU激活HSP的基因表達HSPs的抗腫瘤免疫活性已引起廣泛的關注，因此，HIFU誘導腫瘤細胞產(chǎn)生HSPs的生物學效應如能適當加以利用，可以增強HIFU的免疫調(diào)控能力，具有重要的進一步研究的價值。Control55℃-10s65℃-10s75℃-10s85℃-10sHSPGeneactivationinvivo(Hsp70B-Luciferase)HSPGeneactivationinvitro(Hsp70B-GFP)PhaseContrastFluorescence2mmXYZ超聲空化效應及其引起的腫瘤細胞機械性損傷和內(nèi)源性危險信號的局部釋放空化效應（Cavitation)：組織間的微氣泡在超聲波的負壓相內(nèi)迅速增大，又在正壓相內(nèi)被急劇壓縮至崩潰，產(chǎn)生瞬間的高壓和強大的沖擊波，使氣泡周圍細胞的膜性結構破壞，導致細胞崩潰。超聲空化效應在HIFU發(fā)展之初一般被盡量避免，但隨后研究發(fā)現(xiàn)空化效應可以提高HIFU的治療效果。熱效應HIFUvs

機械性HIFUThermalHIFU:采用較低的超聲壓力以避免誘發(fā)空化效應，但采用較高的占空比以達到HIFU治療中的快速升溫（5s內(nèi)溫度上升至80℃），以模擬傳統(tǒng)HIFU單純的熱效應MechanicalHIFU:采用較高的超聲壓力以誘發(fā)強空化效應，但采用極低的占空比（%DutyCycle）以避免溫度的快速升高，降低HIFU的熱效應TheoutputparametersofThermalandmechanicalHIFUtreatmentsininvitroexperimentsOutputParametersThermalHIFUMechanicalHIFUModulationBurstModeBurstModeFrequency(MHz)1.11.1PRF(Hz)2004P+(MPa)12.031.7P-(MPa)6.710.7DutyCycle(%)303Treatmentduration5s3×10s#PRF:pulserepetitionfrequency.#atanintervalof10s

ThephysicalparametersoftheHIFUexposureconditionsininvivoexperimentTreatmentStrategyP+(Mpa)P-(Mpa)DutycycleDuration(s)Ispta(w/cm2)Mechanical34.112.52%30723Thermal19.97.7100%312751細胞損傷和細胞內(nèi)容物釋放：體外實驗：機械性HIFU導致腫瘤細胞的機械性破碎，內(nèi)容物完全釋放；熱效應HIFU則導致凝固性死亡和內(nèi)容物的不完全釋放，對熱敏感的危險因子如HSP60變性失活，僅對熱穩(wěn)定的危險因子如ATP得以不完全釋放。從HIFU損傷的腫瘤細胞釋放的內(nèi)源性危險信號對DC的激活作用

Up-regulatedexpressionofCD80andCD86andenhancedsecretionofIL-12byDCsafterexposedtosupernatantsofMC-38tumorcellstreatedwithmechanicalorthermalHIFUExposureMeanFluorescenceIntensityIL-12secretionGroupCD80CD86(pg/ml)Medium127±6.1302±30.216.1±3.8Non-treatmentcontrol128±12.4308±26.540.3±5.0MechanicalHIFU154±2.8a402±8.5a111.2±8.9bThermalHIFU145±5.0a372±7.8a57.9±2.5a經(jīng)機械性HIFU裂解的腫瘤細胞上情可刺激體外培養(yǎng)的DC高表達CD80、CD86，并分泌大量的IL-12。比較經(jīng)熱效應HIFU作用的腫瘤細胞上清，雖仍具有激活DC的作用，但生物活性明顯低于前者。

體內(nèi)實驗結果：熱效應HIFU可在3s內(nèi)使組織溫度上升至75度，但幾乎檢測不到空化效應；機械性HIFU處理時瘤內(nèi)溫度控制在55度以下，但引起強空化效應。不同的HIFU治療所致的腫瘤組織損傷mechanical(left)andthermal(right)HIFUtreatmentHIFU治療引起的DC瘤內(nèi)聚集Day1Day2

Non-treatmentThermalHIFUMechanicalHIFUHIFU治療引起的引流淋巴結腫大和DC遷移CFSECD11ca

HIFU誘導的CTL應答和對腫瘤再攻擊的保護作用：經(jīng)HIFU治療的荷瘤小鼠體內(nèi)檢測到顯著增強CTL應答并對腫瘤細胞的再次攻擊產(chǎn)生保護作用。熱效應HIFU誘導的免疫應答低于機械性HIFU。研究結論：HIFU腫瘤治療中從損傷的腫瘤細胞局部釋放的內(nèi)源性的危險信號激活了DC的成熟,是HIFU增強抗腫瘤免疫的重要機制.提示HIFU治療中過渡的熱效應由于導致內(nèi)源性危險信號的部分失活不利于抗腫瘤免疫的誘導，應強調(diào)HIFU適當?shù)臒嵝⒊浞掷每栈斐傻哪[瘤機械性損傷。HIFU有誘導抗腫瘤免疫的潛力，目前的HIFU治療策略并未發(fā)揮出其免疫調(diào)控的最大潛力。進一步優(yōu)化HIFU治療的策略，強調(diào)HIFU適當?shù)臒嵝⒊浞掷贸暱栈獙е碌臋C械性損傷，誘生內(nèi)源性危險信號并促使其最大程度的局部釋放，增強其激活DC，誘導抗腫瘤免疫應答的效能。下一步的工作打算：將HIFU技術