化學(xué)品 水-沉積物系統(tǒng)中穗狀狐尾藻毒性試驗 征求意見稿

5GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品水-沉積物系統(tǒng)中穗狀狐尾藻毒性試驗本文件描述了化學(xué)品水-沉積物系統(tǒng)中狐尾藻毒性試驗的術(shù)語、試驗原理、受試物信息、參比物、試驗材料和條件、試驗程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果報告。本文件適用于評價化學(xué)品尤其是具有除草活性的化學(xué)品對生長在水-沉積物標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)（水、沉積物和營養(yǎng)液）中的根系水生植物穗狀狐尾藻活力的影響。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計量法試驗GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗（I）GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗GB/T21845化學(xué)品水溶解度試驗GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇―水）高效液相色譜法試驗GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇―水）搖瓶法試驗GB/T21855化學(xué)品與pH有關(guān)的水解作用試驗GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗GB/T22052用液體蒸氣壓力計測定液體的蒸氣壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-1Pa至105Pa范圍內(nèi)的測定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測定蒸氣壓平衡法GB/T27850化學(xué)品快速生物降解性通則GB/T42426化學(xué)品蒸氣壓試驗OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.112水中解離常數(shù)（DissociationConstantsinWater）OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310快速生物降解―密閉瓶二氧化碳法（頂空試驗ReadyBiodegradability―CO2inSealedVessels(HeadSpace)］OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316化學(xué)品在水中的光轉(zhuǎn)化直接光解試驗（PhototransformationofChemicalsinWater―DirectPhotolysis）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1水-沉積物系統(tǒng)water-sedimentsystem在實驗室利用水相培養(yǎng)基和人工土建立的水-沉積物試驗系統(tǒng)。6GB/TXXXXX—XXXX3.2測量變量measurementvariable在試驗過程中被測量或被記錄的變量，指穗狀狐尾藻的整株植物的莖長、莖鮮重和莖干重。3.3平均比生長率averagespecificgrowthrate試驗期間穗狀狐尾藻測量變量的對數(shù)增長率，用μ表示。3.4生物量增長量yield試驗期間穗狀狐尾藻莖長、莖鮮重和干重的變化，即一定試驗周期內(nèi)（如14d）最終測量值與最初測量值之差。3.5響應(yīng)變量responsevariable；穗狀狐尾藻的平均比生長率和生物量增長量。4試驗原理將健康、未開花的穗狀狐尾藻的頂芽種植于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，待根系形成后，將植物暴露于一系列受試物濃度或者加標(biāo)沉積物中，在受控的環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)14天。受試物對植物生長的影響可通過莖長、莖鮮重和莖干重的定量評估，以及對黃化、壞死或生長畸形等癥狀的定性觀察來確定。通過莖長、莖鮮重和莖干重計算平均比生長率和生物量增長量，由平均比生長速率（r）和增長量（y）分別確定ErCx（例如ErC10、ErC20、ErC50）和EyCx（例如EyC10、EyC20、EyC50根據(jù)需要可通過平均比生長率和生物量增長量獲得最低觀察到的效應(yīng)濃度（LOEC）和無觀察到的效果濃度（NOEC）。5受試物信息受試物信息包括：a)按照GB/T21845方法測定的水中溶解度；b)按照GB/T21852或GB/T21853方法測定的正辛醇-水分配系數(shù)或關(guān)于分配行為的其他信息；c)按照GB/T21855方法測定的水解作用或按照OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316測定的光穩(wěn)定性或在試驗用水/試驗介質(zhì)中的穩(wěn)定性；d)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229、GB/T42426方法測定的蒸氣壓；e)關(guān)于生物或非生物降解性的信息，如按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857、GB/T27850或OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310測定的快速生物降解性試驗結(jié)果；f)酸解離常數(shù)，如按照OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.112測定的水中解離常數(shù)；g)應(yīng)具備已知準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度的分析方法，明確體系中受試物的定量限，并提供詳細(xì)的樣品前處理和儲存方法。7GB/TXXXXX—XXXX6參比物定期使用參比物如3,5-二氯苯酚（3,5-DCP）檢查試驗程序的有效性。驗證試驗數(shù)據(jù)表明，3,5-DCP對穗狀狐尾藻不同響應(yīng)變量的平均EC50值在4.7mg/L～6.1mg/L范圍內(nèi)。建議每年至少對參比物開展2次試驗，如果測試頻率較低，可在進(jìn)行正式毒性試驗的同時進(jìn)行參比物試驗，確保試驗方法的有效性。7試驗材料和條件7.1儀器設(shè)備除常規(guī)實驗室儀器設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：a)人工氣候培養(yǎng)箱或生長室，其日照長度、光照和溫度應(yīng)可控；b)分析天平；c)pH計；d)溶解氧測定儀；e)溫濕度記錄儀；f)照度計；g)玻璃缸或玻璃燒杯（推薦規(guī)格：2L燒杯，高約24cm，直徑約11cm），試驗容器應(yīng)有足夠的水深滿足植物無限生長，并使植物在整個試驗期間浸沒在水中，其他較大的容器也可適用，其尺寸大小應(yīng)與設(shè)計的試驗體系相符合；h)塑料或玻璃培養(yǎng)缽，其尺寸大小應(yīng)與設(shè)計的試驗體系相符合（在測試疏水性物質(zhì)或正辛醇-水分配系數(shù)較高的物質(zhì)時宜選用玻璃材質(zhì)，推薦體積：約500mL，高約8cm，直徑約9cmi)烘干箱。7.2試驗生物狐尾藻植株可從野外采集、水生植物供應(yīng)商購買和實驗室繁殖獲得，關(guān)于狐尾藻的具體描述見附錄A。如果來源于野外或購買獲得，應(yīng)記錄植物的來源，并核實物種身份。當(dāng)從野外采集狐尾藻時，應(yīng)確保獲得正確的物種，特別當(dāng)采集地是與其他多葉藻雜交的地區(qū)時。建議使用經(jīng)過驗證的已知來源的實驗室培養(yǎng)物，不宜使用污染過的或從已知被污染的地方收集的植物。在試驗前，植物應(yīng)在與試驗條件相似但不一定完全相同的條件下培養(yǎng)/馴化一段時間（如大于2周）。開花的培養(yǎng)植物不應(yīng)用于試驗，因為其在開花期間和開花后營養(yǎng)生長速率普遍下降。7.3試驗條件在實驗中使用暖和或冷白熒光燈來提供光輻照度（波段范圍為400nm～700nm），水面光照強度為120μE/（m2?s）～160μE/（m2?s），在實驗區(qū)域內(nèi)光照強度的任何偏差不應(yīng)超過±15%。光照和黑暗的時間比為16h：8h，試驗水溫控制在18℃~22℃范圍內(nèi)，植物生長的最佳pH范圍為7.5～8.0。在試驗過程中對照組pH的增加不應(yīng)超過1.5個單位，而當(dāng)可以證明滿足規(guī)定的有效性標(biāo)準(zhǔn)時，pH變化超過1.5個單位的偏差不影響試驗的有效性。8試驗程序8.1試驗體系的設(shè)計8.1.1試驗對照組應(yīng)包含至少6個平行的試驗容器；試驗設(shè)置至少5個濃度，每個濃度應(yīng)包含至少48GB/TXXXXX—XXXX個平行的試驗容器。如果不需要測定NOEC，可以改變試驗設(shè)計，增加濃度和減少每個濃度的平行數(shù)。8.1.2每個試驗容器代表1個包含3個頂芽的平行。有下列方法可以確保每個容器中有3株頂芽：a)試驗設(shè)計A：1株頂芽/培養(yǎng)缽，3個培養(yǎng)缽/試驗容器；b)試驗設(shè)計B：3株頂芽/培養(yǎng)缽，1個培養(yǎng)缽/試驗容器；c)可接受每個培養(yǎng)缽1株頂芽，每個容器1個培養(yǎng)缽的試驗設(shè)計，但需對平行數(shù)進(jìn)行調(diào)整以達(dá)到所需的有效性標(biāo)準(zhǔn)。8.1.3每個試驗容器應(yīng)隨機分配到不同的處理組，對試驗區(qū)域中試驗容器的位置進(jìn)行隨機設(shè)計，以盡量減少光照強度或溫度的空間差異造成的影響。8.2試驗濃度的設(shè)計8.2.1濃度通常遵循幾何級數(shù)，試驗濃度之間的間隔系數(shù)不應(yīng)超過3.2，根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果選擇合適的濃度范圍。8.2.2為了確定ECx，試驗濃度應(yīng)包含ECx以確保適當(dāng)?shù)闹眯潘?。例如，最高試驗濃度?yīng)大于EC50的預(yù)估值。如果EC50值在試驗濃度范圍之外，相關(guān)的置信區(qū)間范圍將較大，可能無法對模型的統(tǒng)計擬合進(jìn)行有效評估，設(shè)置更多的試驗濃度有利于獲得高質(zhì)量的ECx值置信區(qū)間。8.2.3為了確定LOEC/NOEC(可選終點)，最低試驗濃度應(yīng)足夠低，以確保處理組植株的生長與對照組無顯著性差異。此外，最高試驗濃度應(yīng)足夠高，使處理組植株的生長顯著低于對照組。設(shè)置更多的平行有利于提高方差分析的統(tǒng)計能力。8.3限度試驗8.3.1當(dāng)預(yù)試驗表明,在受試物濃度高達(dá)100mg/L或受試物在試驗培養(yǎng)基中達(dá)到其溶解度極限或可分散性極限的情況下對生長無不利影響時，可將100mg/L或受試物溶解度極限或1000mg/kg干沉淀物作為試驗濃度，開展包括1個試驗組和1個對照組在內(nèi)的限度試驗。建議將每個對照組和試驗組的平行數(shù)量增加至不少于6個試驗容器。對照組和試驗組的植物增長可使用如Student'st檢驗比較平均值。8.4試驗溶液的配制8.4.1通過稀釋貯備液的方法配制試驗溶液，將受試物溶解或分散在Smart–Barko培養(yǎng)基中，使用蒸餾水或去離子水配制。8.4.2最高試驗濃度通常不應(yīng)超過受試物的水溶解度，針對制劑類的受試物，最高試驗濃度不應(yīng)超過試驗條件下該物質(zhì)的分散性。8.4.3對低水溶性的受試物，可能需要使用有機溶劑或分散劑配制貯備液以便將受試物精確地添加到試驗介質(zhì)中并幫助其分散和溶解，但應(yīng)盡一切努力避免使用助溶劑或分散劑。使用助溶劑或分散劑不應(yīng)產(chǎn)生植物毒性，常用的助溶劑在濃度達(dá)到100μL/L時不會引起植物毒性，如丙酮和二甲基甲酰胺。如果使用助溶劑或分散劑，應(yīng)報告其最終濃度并保持在最低水平（不大于100μL/L）。此時，所有的處理組和溶劑對照組都應(yīng)包含相同濃度的助溶劑或分散劑，不含助溶劑或分散劑的未經(jīng)處理的空白對照組也需納入到試驗設(shè)計中。關(guān)于助溶劑或分散劑的使用指導(dǎo)可參考OECDNo.23。8.5預(yù)培養(yǎng)階段8.5.1從植株上剪下健康的芽尖/頂芽，無側(cè)枝，長度為5cm～6cm。對于試驗設(shè)計A(1株頂芽/培養(yǎng)缽，3個培養(yǎng)缽/試驗容器)，在每個培養(yǎng)缽內(nèi)植入1株穗狀狐尾藻頂芽；對于試驗設(shè)計B(3株頂芽/培養(yǎng)缽，1個培養(yǎng)缽/試驗容器)，在每個培養(yǎng)缽內(nèi)種植4株～5株穗狀狐尾藻頂芽。8.5.2在這兩種情況下(8.5.1)應(yīng)有足量的培養(yǎng)缽植入多余的頂芽以備在試驗開始時選擇生長一致的植物，以及提供備用植物在試驗開始前用于檢查根系的生長發(fā)育情況，備用植物將在第0d用于莖重量9GB/TXXXXX—XXXX和長度的測量。8.5.3頂芽被插入到沉積物表面以下約3cm，至少覆蓋2個莖節(jié)。將培養(yǎng)缽轉(zhuǎn)移至試驗容器中，與試驗暴露相同的環(huán)境條件下，在Smart–Barko培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7天，以誘導(dǎo)根系發(fā)育。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)將多余植株移走，以檢查根系生長情況。如果根生長不可見(即根尖不可見)，則應(yīng)將預(yù)培養(yǎng)階段延長，直至根生長可見，建議采取該步驟以確保植株在試驗啟動時處于良好的生長狀態(tài)。8.5.4對于試驗設(shè)計A(1株頂芽/培養(yǎng)缽，3個培養(yǎng)缽/試驗容器)，在試驗開始前挑選植物生長一致的培養(yǎng)缽；對于試驗設(shè)計B(3株頂芽/培養(yǎng)缽，1個培養(yǎng)缽/試驗容器)，多余的植株將被移除，留下三株大小和外觀一致的植株。8.6通過水相的暴露8.6.1根據(jù)試驗設(shè)計的要求，選擇植物生長一致的培養(yǎng)缽放入試驗容器中，將Smart–Barko培養(yǎng)基添加至試驗容器中，該操作應(yīng)避免擾動沉積物，為此可用漏斗加入培養(yǎng)基（如有需要可在此過程用塑料圓盤覆蓋沉積物，倒入培養(yǎng)基后立即取出或者在添加培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)缽置于試驗容器中。應(yīng)盡量減少藻類和細(xì)菌的潛在積聚，如果有必要可在暴露階段開始時使用新鮮培養(yǎng)基。允許一次性配制好所有平行的受試物試驗溶液，在測試開始時記錄試驗溶液的外觀（如澄清、渾濁等）。8.6.2可先將相應(yīng)量的受試物加入試驗培養(yǎng)基中，也可將受試物直接加入到裝有培養(yǎng)基的試驗容器中，應(yīng)注意確保受試物均勻地分布在整個測試系統(tǒng)中，且不擾動沉積物。8.6.3添加培養(yǎng)基前或后，應(yīng)測量沉積物上方的莖長。8.7通過沉積物的暴露8.7.1通過直接向新鮮沉積物中添加受試物溶液制備所需濃度的加標(biāo)沉積物，受試物溶解在去離子水中，通過軋機、攪拌機或手工攪拌，與配制好的沉積物充分混合。如果受試物難溶于水，可將其溶解在盡可能小體積的合適有機溶劑中（如正己烷、丙酮或氯仿），將該溶液與約10g細(xì)石英砂混合，待溶劑揮發(fā)后，將沙子與每個試驗容器中適量的沉積物混合，只有易揮發(fā)的溶劑才可用于溶解、分散或乳化受試物。在最終制備沉積物時，應(yīng)考慮摻有受試物的沙子的體積/重量（即沉積物應(yīng)使用較少的沙子制備）。應(yīng)確保添加到沉積物中的受試物均勻分布。8.7.2將加標(biāo)的沉淀物裝入培養(yǎng)缽中，從預(yù)培養(yǎng)階段中取出生長一致且具備充足根系的植株植入到加標(biāo)沉積物中。8.7.3將培養(yǎng)缽放入試驗容器中，小心地加入Smart-Barko培養(yǎng)基（如使用漏斗避免擾動沉積物。8.7.4在添加培養(yǎng)基前或后，測量沉積物上方的芽長。8.8試驗環(huán)境條件的維持和測定8.8.1應(yīng)記錄最終溶液體積，并在每個試驗容器上標(biāo)記水位。如果在測試過程中水分蒸發(fā)超過10%，則應(yīng)補充蒸餾水調(diào)整水位；如有必要，可用透明蓋子（如透明塑料蓋）松散地覆蓋容器，以盡量減少水分蒸發(fā)和藻類的污染。上覆水水深應(yīng)高于沉積物頂部12cm，并應(yīng)分別記錄沉積物的表面積/體積和上覆水面積/體積的比值。8.8.2另外準(zhǔn)備試驗容器，加入培養(yǎng)基并置于相同的環(huán)境條件下，用于每天記錄試驗容器所在環(huán)境如培養(yǎng)箱、人工氣候室的溫度，或用溫度記錄儀連續(xù)記錄試驗環(huán)境中的溫度。8.8.3至少在試驗開始、試驗期間和結(jié)束時，在同一時間測定所有試驗容器的溶解氧和pH。如果試驗開始時（0d）配制不同濃度的試驗溶液分裝至不同平行容器中，可只測定分裝前的不同濃度試驗溶液的溶解氧和pH即可。8.8.4在試驗開始或試驗過程中，至少進(jìn)行1次光照強度的測定，應(yīng)在生長箱、培養(yǎng)箱或房間中與容器內(nèi)水位等高的位置上測定光照強度。光照強度的測定方法與傳感器的類型相關(guān)，與單向傳感器相比，GB/TXXXXX—XXXX球形傳感器（對測量平面上方和下方的所有角度的光作出響應(yīng)）和余弦傳感器（對測量平面上方的所有角度的光作出響應(yīng)）更有利于準(zhǔn)確測定，并且多點光源易給出更高的讀數(shù)結(jié)果。8.9生長指標(biāo)的分析測定8.9.1在預(yù)培養(yǎng)階段結(jié)束后至試驗開始前（即第0d），從備用的植株中隨機選擇5個培養(yǎng)缽（3株/培養(yǎng)缽）或15個培養(yǎng)缽（1株/培養(yǎng)缽），評估莖長、莖鮮重和莖干重。8.9.2當(dāng)植株植入暴露體系后，相關(guān)指標(biāo)測定如下：a)至少在試驗結(jié)束時（第14d），測定和記錄莖長、側(cè)枝數(shù)量和側(cè)枝的長度；b)暴露過程中至少觀察和記錄3次（如0d、7d、14d)植物生長和健康狀況；c)試驗結(jié)束時（如第14d），測定和記錄莖的鮮重和干重。8.9.3可使用尺子測量莖長，如果存在側(cè)枝，同時記錄側(cè)枝的數(shù)量和長度。試驗過程中觀察和記錄植物的外觀和試驗培養(yǎng)基的狀況以對植物的健康狀況進(jìn)行評估。觀察結(jié)果包括：a)黃化，壞死或者其他變色現(xiàn)象如與對照組植株相比過度變紅；b)細(xì)菌或藻類污染；生長異常，如發(fā)育遲緩、節(jié)間長度改變、莖/葉扭曲、側(cè)芽增殖、葉片損失、膨大體損失和莖斷裂；c)試驗結(jié)束時，仔細(xì)清洗根部的沉積物以對根部系統(tǒng)的健康狀況進(jìn)行評估，與對照組相比，是否存在根系缺失、減少、中度發(fā)育或與對照接近較好的發(fā)育情形。8.9.4在試驗的開始和結(jié)束時，對莖鮮重進(jìn)行評估。在沉積物水平上切割枝條，小心去除可能粘附在芽基部的沉積物顆粒，吸干水分后稱鮮重，將植株放入約60℃干燥箱中烘干至恒重，稱量并記錄干重。相關(guān)指標(biāo)的具體測定時間見表1。表1相關(guān)指標(biāo)測定的時間表0√√√√4――――7―√―√√√√√8.10受試物濃度分析8.10.1應(yīng)通過受試物濃度的分析來確定受試物的正確施用量。在試驗開始后不久（穩(wěn)定的受試物于試驗當(dāng)天，不穩(wěn)定的受試物于試驗開始1h內(nèi)），以及在試驗結(jié)束時，采集水樣進(jìn)行濃度分析。8.10.2在試驗開始和試驗結(jié)束時測定沉積物和沉積物孔隙水中的受試物濃度，至少測定最高試驗濃度，除非已知受試物在水中穩(wěn)定（大于理論濃度的80%）。如果已有水–沉積物在類似條件下（例如沉積物與水的比例、使用方法、沉積物類型）的研究明確表明受試物在水–沉積物之間的分配行為，則無需對沉積物和孔隙水進(jìn)行濃度分析。GB/TXXXXX—XXXX8.10.3在試驗開始時對沉積物取樣很可能會破壞試驗系統(tǒng)，因此需要額外的試驗容器用于試驗開始和結(jié)束時的濃度分析。如果認(rèn)為有必要進(jìn)行中期評估，如在第7d進(jìn)行評估，而分析需要大量難以從測試系統(tǒng)中獲取的沉積物樣本，則應(yīng)設(shè)置額外的試驗容器用于分析測定。額外試驗容器的準(zhǔn)備方式與生物評估所用的試驗容器方式相同。8.10.4可采用10000g，4℃離心30min獲得間隙水，如果已證明受試物不被濾膜吸附，也可采用過濾的方式。如果樣本量太小，可能無法分析孔隙水中的受試物濃度。8.10.5如果受試物濃度在試驗期間不能保持在理論濃度的±20%范圍內(nèi)，應(yīng)開展半靜態(tài)試驗（如水相暴露在每次更換溶液時，應(yīng)對新配制的試驗溶液和舊試驗溶液進(jìn)行采樣和受試物濃度分析。如果受試物的初始實測濃度不能達(dá)到理論濃度的±20%，但有證據(jù)表明初始濃度是可重復(fù)和穩(wěn)定的（即在初始濃度的80%～120%范圍內(nèi)），可只對最高和最低的試驗組進(jìn)行濃度測定。8.10.6只需對每個濃度下的1個平行容器進(jìn)行受試物濃度的測定，也可將每個濃度所有平行的試驗溶液混合后用于濃度分析。8.10.7如果已有證據(jù)表明，在整個試驗過程中，受試物的實測濃度能夠保持在理論濃度或初始濃度的±20%范圍內(nèi)，可基于理論濃度或初始濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和毒性終點的估算，此時效應(yīng)濃度應(yīng)基于理論濃度或測定的初始濃度。如果有證據(jù)表明受試物濃度在試驗過程中出現(xiàn)了下降（即在處理組中不能保持在理論濃度或初始濃度的±20%以內(nèi)），應(yīng)基于暴露期間實測濃度的時間加權(quán)平均值或受試物濃度下降模型對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，更多的關(guān)于受試物效應(yīng)濃度的計算可參考OECDNo.23。9質(zhì)量保證與質(zhì)量控制如滿足以下條件，試驗結(jié)果有效。a)試驗期間，對照組的平均總莖長和莖總鮮重至少是試驗開始時的2倍。b)對照組植物不得出現(xiàn)任何黃化的癥狀，沉積物和試驗培養(yǎng)基無明顯藻類和/或細(xì)菌等其他生物的污染。c)從試驗開始到試驗結(jié)束，對照組平行之間植物莖鮮重生物量變異系數(shù)的平均值不超過35%。10數(shù)據(jù)統(tǒng)計10.1響應(yīng)變量10.1.1如果使用了助溶劑或分散劑，助溶劑對照組和空白對照組的結(jié)果在統(tǒng)計上無顯著性差異時，助溶劑對照組和空白對照組的數(shù)據(jù)可合并用于統(tǒng)計分析。采用平均比生長率和生物量增長量兩個響應(yīng)變量評估受試物對植物生長的影響。10.1.2平均比生長率是基于對照組和每個處理組的總莖長、總莖鮮重和總莖干重隨時間的對數(shù)變化。對照組和處理組的每個平行均需統(tǒng)計，按照公式(1)計算每個試驗容器（平行）的3株植物的平均長度和重量以及隨后每個平行的生長速率。μi?j=…………（1）式中：——從i時間到j(luò)時間的平均比生長率；Ni——在時間i時處理組或?qū)φ战M的測量變量；Nj——在時間j時處理組或?qū)φ战M的測量變量；GB/TXXXXX—XXXXt——從i到j(luò)的時間，單位為天(d)。10.1.3應(yīng)計算整個試驗周期每個處理組和對照組中的生長率平均值和方差值，按照公式(2)計算每個試驗濃度（處理組）的生長抑制百分率（Ir）?！?00…………(2)式中：Ir——平均比生長率的抑制率，單位為百分率(%);μc——空白對照組的平均比生長率；μt——處理組的平均比生長率。10.1.4基于對照組和每個處理組總莖長、總莖鮮重和總莖干重隨時間的變化，按照公式（3）計算生物量增長量抑制百分率（Iy）。%Iy=×100…………（3）式中：Iy——生物量抑制百分率，單位為百分率(%);bc——空白對照組最終生物量與初始生物量之差；bt——處理組的最終生物量與初始生物量之差。10.2濃度–效應(yīng)曲線10.2.1根據(jù)上述的穗狀狐尾藻的平均比生長率抑制率（Ir）和生物量增長量抑制率（Iy）繪制受試物的濃度對數(shù)-效應(yīng)曲線。10.2.2基于總莖鮮重、總莖干重和總莖長的平均比生長率（ErCx）和生物量增長量（EyCx）分別估算ECx。應(yīng)該注意的是，使用這兩個響應(yīng)變量計算獲得的ECx值不具有可比較性。由于各自方法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)不同，在遵守本文件測試條件下，基于平均比生長率的ECx值（ErCx）在大多數(shù)情況下高于基于生物量的ECx值（EyCx這種差異不是兩個響應(yīng)變量之間的敏感性差異，僅在數(shù)值上存在區(qū)別。10.2.3通過回歸分析獲得定量的濃度-響應(yīng)關(guān)系，在對響應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性化轉(zhuǎn)換后，可使用加權(quán)線性回歸，例如將其轉(zhuǎn)換為probit、logit或Weibull單位，但非線性回歸是處理數(shù)據(jù)不規(guī)則和偏離平滑分布的首選方法，接近零抑制或完全抑制時，這種不規(guī)則會被轉(zhuǎn)換放大，干擾統(tǒng)計分析。probit、logit或Weibull轉(zhuǎn)換的標(biāo)準(zhǔn)分析方法適用于不連續(xù)的數(shù)據(jù)（如死亡率或生存率而更多關(guān)于如生長率或生物量之類的連續(xù)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換方法可參考指南文件OECDNo.54。10.2.4對于每個需要分析的響應(yīng)變量，使用濃度-響應(yīng)關(guān)系計算ECx值的點估計值，確定其95%置信限，并應(yīng)以圖形或統(tǒng)計的方式評估響應(yīng)數(shù)據(jù)對回歸模型的擬合度?；貧w分析應(yīng)使用每個平行的效應(yīng)值，而不是處理組的平均值。如果可用的回歸模型/方法對數(shù)據(jù)不適用，也可使用線性插值方法獲得EC50值和置信限。10.2.5使用方差分析方法（ANOVA）對每個處理組的平均值與空白組的平均值進(jìn)行比較，通過適當(dāng)?shù)谋容^方法（如Dunnett′s,Williams′stest）獲得LOEC和NOEC。采用Shapiro-Wilks-test或Levene′stest統(tǒng)計方法，通過方差分析假設(shè)正態(tài)分布和方差齊性是否成立，不滿足正態(tài)分布和方差齊性的假GB/TXXXXX—XXXX設(shè)可通過數(shù)據(jù)的對數(shù)變換來校正。如果方差不齊和/或與偏離正態(tài)分布，且不能通過變換加以校正，則應(yīng)考慮采用Bonferroni-Welch-test、step-downJonkheereTerpstratest、Bonferroni-Median-Test等方法進(jìn)行分析。11結(jié)果報告試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容。a)受試物：1)單組分物質(zhì)：物理性狀、水溶解性及相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)標(biāo)識，如國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）名稱或CAS名稱、CAS號、簡化分子線性輸入規(guī)范（SMILES）碼或國際化合物標(biāo)識（InChI）碼、結(jié)構(gòu)式、純度等信息，在適當(dāng)情況下還應(yīng)提供雜質(zhì)的化學(xué)鑒別信息；2)多組分物質(zhì)、不明復(fù)雜物質(zhì)（UVCBs組分未知或者可變的物質(zhì)、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或者生物材料）和混合物：盡可能提供各組分的化學(xué)鑒別信息（如上）、含量和相關(guān)的物理-化學(xué)特性；b)測試物種：科學(xué)名稱和來源。c)試驗條件：1)培養(yǎng)階段的條件和周期；2)試驗方式（如靜態(tài)、半靜態(tài)、脈沖式）；3)試驗開始的時間和周期；4)試驗培養(yǎng)基的組成，如沉積物和液體營養(yǎng)成分；5)試驗的設(shè)計，如植物生長的空間/實驗室、試驗容器、試驗體積、試驗開始時每個試驗容器植物的長度和重量、沉積物和水的表面積比、沉積物和水的體積比；6)試驗濃度（理論濃度或者實測濃度），每個濃度處理組的平行數(shù)；7)受試物貯備液和試驗溶液的配制方法，使用的助溶劑或分散劑（如有）；8)試驗溫度；9)光照源，輻照強度；10)試驗開始和結(jié)束時的pH，溶液狀態(tài)；11)溶解氧；d)分析方法：測定長度、鮮重和干重的方法。e)統(tǒng)計方法：使用合適的分析方法評估數(shù)據(jù)的質(zhì)量，檢驗方法、分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。f)結(jié)果：1)根據(jù)表1中提供的評估時間表，在每次觀察和分析時，每個處理組和對照容器中植物/培養(yǎng)缽的莖長和莖鮮重以及其他測量變量；2)每個測量變量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差；3)每個濃度的生長曲線；4)基于莖長和鮮重的雙倍對照生長速率，包括生物鮮重增長量的變異系數(shù)；；5)計算每個處理組響應(yīng)變量，包括不同平行之間的平均值和變異系數(shù)；6)濃度-效應(yīng)關(guān)系圖；7)估算響應(yīng)變量（如EC50）的毒性終點和相關(guān)置信區(qū)間，如果計算LOEC和/或NOEC，提供統(tǒng)計方法。8)如果使用了方差分析，則可以檢測到的效應(yīng)大?。ɡ缱钚★@著差異）；9)濃度組可觀察到的任何生長刺激效應(yīng)；GB/TXXXXX—XXXX10)任何可見的植物毒性跡象以及對試驗溶液的觀察；11)討論結(jié)果，包括偏離本文件對測試結(jié)果的任何影響。GB/TXXXXX—XXXXA穗狀狐尾藻的描述A.1本文件中描述的方法主要針對穗狀狐尾藻，也可用于測試一系列水生植物物種。穗狀狐尾藻屬于雙子葉植物綱，小二仙草科，是一種多年生沉水植物。穗狀狐尾藻為世界廣泛分布，產(chǎn)于全球的淡水水域，可以耐受各種條件，在靜態(tài)和流動的水體中均可生長。A.2冬天枝葉枯萎，根部埋在沉積物中，來年春天再次發(fā)芽生長。狐尾藻植株通常能自由開花和結(jié)果，從自然脫落的斷枝或根狀莖進(jìn)行無性繁殖，是狐尾草繁殖的主要方法。A.3冬季不容易獲得狐尾藻的地區(qū)，可能需要在溫室或?qū)嶒炇覘l件下長期貯備培養(yǎng)。雖然可降低輻照度和溫度以減少培養(yǎng)液更新的頻率（例如當(dāng)一段時間內(nèi)沒有計劃進(jìn)行狐尾藻試驗時但貯備培養(yǎng)物應(yīng)保持在與試驗條件相似的條件下，且建議使用比試驗中更大的水族箱或培養(yǎng)缽，以留出足夠繁殖空間。沉積物和水介質(zhì)的組成應(yīng)與試驗中使用的相同，也可使用其他沉積物施肥的方法（例如使用商業(yè)緩釋肥A.4貯備培養(yǎng)物應(yīng)不受到任何其他生物體的污染，包括蝸牛、絲狀藻類、真菌和昆蟲，如：飛蛾的卵或幼蟲以及象甲的幼蟲或成蟲，有必要用淡水沖洗植物以消除可見的污染。此外，盡管植物不需要完全無菌，應(yīng)盡量減少單細(xì)胞藻類和細(xì)菌的污染。應(yīng)對貯備培養(yǎng)的植物進(jìn)行檢測，必要時進(jìn)行移植，以避免藻類和細(xì)菌污染的發(fā)展。當(dāng)藻類或細(xì)菌污染成為問題時，對貯備培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行通氣可能起到效果。GB/TXXXXX—XXXX培養(yǎng)基和沉積物的配制B.1Smart-Barko培養(yǎng)基宜使用Smart-Barko培養(yǎng)基培養(yǎng)穗狀狐尾藻和進(jìn)行毒性試驗，用去離子水或蒸餾水配制Smart-Bar