醫(yī)學免疫學第22章-免疫學檢測技術

第二十二章免疫學檢測技術P193復習抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合

抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合抗原或抗體檢測原理：借助抗原和抗體在體外特異結合后出現的各種現象，對標本中的抗原或抗體進行定性或定量的檢測。Equivalence–Latticeformation抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合抗原或抗體檢測原理一種細菌可以刺激多少種抗體產生？抗原抗體（Antibody)抗體（Antibody，Ab)免疫球蛋白的雙重性免疫球蛋白是一種蛋白質，是抗體(Ab1)；同時又可引起機體產生抗體（抗抗體,Ab2），所以既是抗體又是抗原。

AgAb1Ab2

免疫學檢測技術主要應用：對多種免疫性疾病的診斷、療效評估、發(fā)病機制探討;對抗原性物質、免疫細胞、細胞因子、粘附分子或細胞受體等的定性、定量檢測。第一節(jié)體外抗原抗體結合反應

的特點及影響因素

抗原-抗體反應包括：沉淀反應、凝集反應、溶解反應、補體結合反應、中和反應等。

抗原-抗體反應可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。免疫標記技術包括：免疫酶技術、免疫熒光技術、同位素標記技術、化學發(fā)光免疫技術、免疫膠體金技術等。（一）抗原-抗體反應的特點：P1931.高度特異性：抗原-抗體的特異性結合。2.

可逆結合：抗原抗體分子表面的非共價鍵結合。4.反應的兩個階段：

特異性結合階段；可見的反應階段。3.

濃度和比例：是否呈現可見的反應現象，與抗原和抗體兩者的分子濃度和比例密切相關?？乖贵w比例對反應現象的影響（二）抗原-抗體反應的影響因素1.電解質：抗原-抗體反應通常應用0.85%的氯化鈉（適當濃度的電解質）作為稀釋液。2.溫度：反應常在37℃水浴或孵育箱中進行。3.酸堿度：抗原-抗體反應適應的酸堿度

為pH6-8?？乖?抗體反應受多種因素影響第二節(jié)檢測抗原或抗體的體外試驗凝集反應沉淀反應（中和反應）免疫標記技術：用標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應蛋白質芯片技術一、凝集反應

(Agglutination)

細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合、凝集的現象。1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應，出現細菌凝集或紅細胞凝集現象。又分為玻片法（定性試驗）和試管法（半定量試驗）。常見血清學檢測1.凝集反應直接凝集反應1:2稀釋待測血清1:41:81:16細菌、細胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質與相應Ab在電解質存在的情況下結合，出現肉眼可見的凝集團現象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定常用于檢測抗體的滴度或效價，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達氏反應和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗。一、凝集反應

(Agglutination)2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，形成致敏顆粒，與相應抗體反應出現的顆粒凝集現象。間接凝集反應將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應Ab/Ag進行反應產生凝集，叫間接凝集反應。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風濕因子檢測。凝集反應常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內anti-Rh由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細胞間的結合力不能克服細胞間的排斥力，不出現凝集+YYYYYYYYYYYYYY+Y體外加入抗人IgG出現凝集現象，叫直接庫姆試驗正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現凝集現象，叫間接庫姆試驗血球凝集二、沉淀反應

（Precipitation)

血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后出現沉淀物，稱為沉淀反應。沉淀反應AgAgAgAgAbingel單向免疫擴散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應抗體反應后，出現肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應。沉淀反應可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度沉淀反應—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數量、位置和形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質。1.單向免疫擴散

(SingleImmunodiffusion)將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板；打孔，將抗原加入孔中擴散?？乖c抗體相遇，形成沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)2.雙向免疫擴散

（DoubleImmunodiffusion)將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，可出現兩條以上的沉淀線。常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關性分析的檢測。3.免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)將待測血清標本作瓊脂凝膠電泳，不同分子量蛋白組分開，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應的抗血清，與不同區(qū)帶的蛋白抗原作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白種類分析。4.火箭電泳（RocketElectrophoresis)也稱免疫擴散，是把單向免疫擴散同電泳結合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。特點：需時較短，用于快速沉淀標本中抗原含量的測定?；鸺娪臼疽鈭D3.免疫標記技術P194檢測原理通過免疫學中抗原抗體結合反應，用特異性抗體(單克隆或多克隆)或抗原檢測組織、細胞內相應的抗原或抗體物質，形成抗原-抗體復合物；利用此復合物上帶有預先標記的標記物，通過與標記物相對應的檢測系統(tǒng)，如酶底物顯色反應可使之呈現某種顏色，從而可檢測組織細胞內的抗原，以達到診斷、鑒別診斷和研究的目的?？勺鳛榭乖奈镔|有酶、受體、抗體、細胞外基質激素、細胞結構蛋白、病原體。免疫標記物顯色原理（1）免疫酶測定法（2）免疫熒光技術（3）放射免疫測定法（4）發(fā)光免疫分析（5）免疫膠體金技術（6）免疫印跡技術（1）免疫酶測定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。a）b）免疫組化技術定位、定性、定量檢測（2）免疫熒光技術P195將熒光素（異硫氰酸熒光素，FITC、藻紅蛋白，PE)與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復合物散發(fā)出熒光，對標本中抗原的鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補體法。直接熒光法：將熒光素直接標記抗體作標本染色。優(yōu)點：是特異性強。缺點：每檢測一種抗原必須制備相應的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標本中的抗原結合，再用熒光素標記的二抗染色。優(yōu)點：敏感性比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測。補體結合免疫熒光法：在間接法的第一步抗原-抗體反應時加入補體，使之與抗原-抗體復合物結合；再用熒光素標記的抗C3抗體進行示蹤。間接免疫熒光法示意圖免疫熒光顯微技術海馬細胞微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)

培養(yǎng)的成纖維細胞微管呈綠色核呈藍色流式細胞術（FlowCytometry,FCM)

FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數（如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等）進行多信息分析。流式細胞術流式細胞儀工作原理（3）放射免疫測定用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結合的特異性結合起來，具有重復性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應用于激素、藥物等微量物質的檢測。常用的有131I、125I。放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術。放射性核素顯示的高靈敏性，使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。（4）化學發(fā)光免疫技術P196將化學發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立的一種新的免疫分析技術。最常用的發(fā)光物質是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實現自動化分析?；瘜W發(fā)光免疫測定生物發(fā)光免疫測定化學發(fā)光酶免疫測定電化學發(fā)光免疫測定⑤免疫膠體金技術用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術可應用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。⑥免疫印跡法-Westernblotting免疫印跡法（Immunoblotting）將凝膠電泳與固相免疫測定結合，先把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術測定。能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量。常用于檢測多種病毒（如HIV）的抗體或抗原。免疫印跡法示意圖生物芯片基因芯片蛋白質芯片微流控芯片蛋白質芯片,又稱蛋白質陣列或蛋白質微陣列，是指以蛋白質分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的抗體或其他它分子與之作用，洗去未結合的成分，經熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，熒光強度將指示蛋白質對應抗體及其相互結合的程度。微生物檢測、腫瘤篩查。

4.蛋白質芯片技術研究蛋白質芯片的意義蛋白質是基因表達的最終產物,接近生命活動的物質層面；探針蛋白特異性高、親和力強,可簡化樣品前處理，甚至可直接利用生物材料(血樣、尿樣、細胞及組織等)進行檢測；適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物；有助于了解藥物或毒物與其效應相關蛋白質的相互作用。蛋白質檢測芯片

蛋白質功能芯片

蛋白質芯片的分類PoetzOet.al,MechanismsofgeingandDevelopment,2005,126,161–170.第三節(jié)免疫細胞功能的檢測

（自學+實驗）（P197-202）檢測各種淋巴細胞的數量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結等作為標本進行檢查。(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上T細胞功能測定體外法：T細胞增殖試驗形態(tài)學檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內法：用生物抗原或化學抗原作皮內試驗。OT-PPD皮試

一、T細胞功能的檢測T細胞增殖試驗T細胞分泌功能測定T細胞介導的細胞毒試驗體內試驗（一）T淋巴細胞增殖試驗1.原理：淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質疏松

未轉化和轉化淋巴細胞的形態(tài)特征轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無2.淋巴細胞轉化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細胞

ConA-------T細胞

PWM-------T、B細胞

LPS-------B細胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原

3.檢測方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細胞（4-6天）母細胞化同位素法：PHA淋巴細胞（54h）

DNA合成期+3HTdR摻入

收集細胞

檢測β射線

測定細胞內的3H－TdR（1）形態(tài)學檢查法方法學評價：優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗室應用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性MTT測吸光度(3)MTT比色法(二)T細胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細胞經各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。

（三）T細胞介導的細胞毒試驗1.原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞形態(tài)學方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數殘留腫瘤細胞2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

圖15-2T細胞細胞毒試驗示意圖靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時51Cr釋放法(四)體內試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗二、B細胞功能檢測B細胞增殖能力的試驗溶血空斑試驗B細胞抗體形成功能的檢測體內試驗(一)B細胞增殖能力的試驗抗IgM細菌脂多糖SAC的SPA

B細胞增殖形態(tài)學3H－TdR摻入法(二)溶血空斑試驗1.原理：2.方法學：經典溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗

3．臨床應用與評價溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產生抗體的能力。

(三)

B細胞抗體形成功能的檢測

——酶聯免疫斑點法1.原理：2．應用與方法學評價：該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。(四)體內試驗體內抗體產生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判斷受檢者體內B細胞的功能。染色計數離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細胞熒光測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學發(fā)光法三、NK細胞活性測定靶細胞溶解常用靶細胞:

K562細胞株培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細胞增殖試驗（3H-TdR摻入法）示意圖靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細胞毒試驗（51Cr釋放法）示意圖：（Na51CrO4標記靶細胞）細胞毒試驗（乳酸脫氫酶釋放法）

正常情況下，乳酸脫氫酶（LDH）存在于細胞內，細