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TechniquestomanipulateDNAPhenol/chloroformextractionEthanolprecipitationConcentrationdeterminationGelElectrophoresisDNAhybridizationSouthernBlottingMeltingtemperaturesPCRBRCA3EcoRIEcoRINIHExample:IstheBRCA3geneinvolvedinSuppressingbreastcancer?BRCA1BRCA2BRCA3PaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinThe“HyperchromicShift”2PaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinAgaroseGelElectrophoresis_+3SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisSybergoldDetectionLimit:~0.2-0.5ngDNAEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA(Notinhandout)Log(MW)islinearlyrelatedtomobility4100bpLow%hasnoResolvingpoweratlowMW1kb10kbHigh%hasnoresolvingpowerathighMWSeparationRangeVs.%Agarose5LowGelingAgarose4-6 0.02-0.4TEMED(N,N,N,N-tetramethylenediamine)7PolyAcrylamideGels8DNAtopologyaffectsmobilityofDNA9PFGEcanresolvelargeDNAfragments10PaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinHelixFormation:NucleationandPropagation11A-TA-TG-CHelixMelting12Whatparametersaffectthe

Tm?

(Tmisdefinedasthetempat

whichhalfthemolecules

aresingle-stranded)TmdependsonDNAlength13%dsDNASigmoidalCurve:HighlyCooperativeMelting!Effectof%GCContentonTm14Effectof[Salt]onTm15Predictingmeltingtemperatures(seelecturenotes)KineticsofHybridization:

DoIhavetimeforasodaora

week-endinNewYorkCity?CotCurves:Hybridizationvs.Complexity16ABi-PhasicCotCurve175kbRepeats(20%total)100kbfragmentRepeatDNA=5kbLongestnon-repeatDNA=100kb-20kb=80kbDifferenceincomplexity=80/5=16PaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueBRCA3EcoRIEcoRINIHBRCA3EcoRIEcoRINIH94C(30s)40-60C(30s)72C(30-60s/kb)MeltAnnealExtendThePolymeraseChainReaction(PCR)1820-30X94C(30s)40-60C(30s)72C(30-60s/kb)MeltAnnealExtendCycle#2NIH20-30XResultsofPCR#1ControlTissueCancerTissueBRCA3EcoRIEcoRINIHPrimerSet#1ResultsofPCR#5ControlTissueCancerTissueBRCA3EcoRIEcoRINIHPrimerSet#5PCRmutagenesisEcoRIHindIIIIsolateproducts,mixAmplifydigest,subclonesequence20PvuIILinearAmplificationGeometricAmplification19hsp70EcoRIEcoRINIHExample:Isheatshockfa

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