MRSA耐藥機(jī)制及檢測(cè)方法

MRSA耐藥機(jī)制及檢測(cè)方法府偉靈第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院檢驗(yàn)科overviewMRSA，methicillinresistantStaphylococcusaureus（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）1961年在英國(guó)由Jevons首次發(fā)現(xiàn)，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一

overviewoverview不均一耐藥性MRSA菌落內(nèi)存在敏感和耐藥兩個(gè)亞群，即一株MRSA中只有一小部分細(xì)菌約10－4～10－7，對(duì)甲氧西林高度耐藥，在50μg/ml甲氧西林條件下尚能生存，而菌落中大多數(shù)細(xì)菌對(duì)甲氧西林敏感，在使用抗生素后的幾小時(shí)內(nèi)大量敏感菌被殺死，但少數(shù)耐藥菌株卻緩慢生長(zhǎng)，在數(shù)小時(shí)反又迅速增殖。

overviewoverviewoverviewEpidemicstatus全球：1993年，日本Kansai醫(yī)大附院MRSA分離率為41%1999年，英國(guó)30個(gè)監(jiān)測(cè)中心MRSA檢出率最高為56.7%

1999年，根據(jù)美國(guó)疾病控制中心(CDC)統(tǒng)計(jì)，全美重癥監(jiān)護(hù)病房MRSA感染率為52.3%Epidemicstatus中國(guó)：自70年代發(fā)現(xiàn)有MRSA以來(lái)，近幾年MRSA的檢出率正在逐年上升

1989年，上海地區(qū)MRSA的分離率為60%，1996年激增至72%

1999-2001年，重慶地區(qū)MRSA分離率為65.1%ResistancemechanismResistancemechanismResistancemechanismmecA基因mec即甲氧西林耐藥決定因子，是整合到葡萄球菌上的30～50kb的外來(lái)插入片段，其中mecA基因是PBP2a的編碼基因，是MRSA的主要耐藥基因mecA基因存在于MRSA和部分凝固酶陰性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococci,CNSorCoNS)中，mec片段末端存在末端反向重復(fù)序列，且均插入到環(huán)狀染色體的SmaI－G部位編碼A蛋白的spa基因和腺嘌呤生物合成必須的purA基因之間，具有位置特異性mecA基因mecDNA片段（52kb）是可移動(dòng)的遺傳元件，命名為葡萄球菌染色體mec盒（staphylococcalchromosomalcassettemec，SCCmec），包括mec及ccr基因復(fù)合體SCCmec可以以多種的插入方式插入到其它的染色體和質(zhì)粒中，使耐藥性進(jìn)行水平性的轉(zhuǎn)移或者在不同家系的葡萄球菌間傳播影響mecA表達(dá)的因素影響mecA表達(dá)的因素影響mecA表達(dá)的因素溫度、pH值、鹽離子濃度對(duì)mecA基因的表達(dá)亦有影響研究表明，溫度30～35℃，pH值7.0～7.2，鹽濃度4％時(shí)mecA基因表達(dá)最強(qiáng)，PBP2a產(chǎn)量最多（MIC最高）其他耐藥相關(guān)基因其他耐藥相關(guān)基因fem基因fem因子（factorsessentialformeticillinresistance），是金黃色葡萄球菌染色體中的固有基因，包括femA、femB、femC、femD、femE、femF。hmrC、hmrD和chr基因是染色體突變基因，引起MRSA對(duì)甲氧西林的高度耐藥，其機(jī)制尚未闡明

fem基因1femA和femB為兩個(gè)相連的開放閱讀框，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的五甘氨酸側(cè)鏈以及肽間橋的生物合成是必需的。當(dāng)其失活時(shí)，MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素以及多種其它類抗生素的耐藥性降低2femC的作用引起谷氨酰胺合成酶基因glnA轉(zhuǎn)錄和活化及異谷氨酰胺的酰胺化，其失活時(shí)，糖肽的交叉連接降低，MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥性降低

2femF基因的編碼產(chǎn)物涉及L-賴氨酸與胞壁酰二肽鏈的連接，其突變失活時(shí)引起的耐藥性的改變得具體機(jī)制還有待研究。femD和femE對(duì)細(xì)菌的確切作用還未闡明

DetectionforMRSAMALDI-TOFMS細(xì)菌指紋圖譜法

傳統(tǒng)方法

藥物敏感試驗(yàn)方法

NCCLS推薦使用藥敏紙片法、苯唑西林(oxacillin)鹽瓊脂篩查法、β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)、E-test試驗(yàn)和試管雙倍稀釋法等缺點(diǎn)：易受培養(yǎng)基成分影響，較耗時(shí)，且錯(cuò)誤應(yīng)用抗生素會(huì)引起更為嚴(yán)重耐藥的耐藥菌株的出現(xiàn)快速乳膠(Latex)凝集法PBP2a單克隆抗體致敏的乳膠顆粒與MRSA的膜蛋白提取物作用,產(chǎn)生肉眼可見的凝集顆粒,證實(shí)有PBP2a的存在,以此判斷該菌為MRSA此法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,檢測(cè)1份標(biāo)本只需15min，和PCR法一樣有極高的靈敏度和特異性，有較好的應(yīng)用前景

免疫學(xué)方法基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜可簡(jiǎn)易分析低純度的固體混合物樣品,檢測(cè)范圍可到350KD。根據(jù)細(xì)菌的全細(xì)胞圖譜差異，鑒定未知細(xì)菌。耗時(shí)少，重復(fù)性高缺點(diǎn)：要求特殊儀器，結(jié)果處理方法復(fù)雜，不適于普遍開展

分子生物學(xué)方法

PCR法mecA基因高度保守,根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)不同的引物,用PCR對(duì)菌株中PBP2a靶DNA特定片段mecA進(jìn)行擴(kuò)增,以mecA基因存在與否判定是否為MRSA

菌株，不受藥敏實(shí)驗(yàn)條件的影響,因而特異性高,被公認(rèn)為是其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。mecA和femB基因表達(dá)均為陽(yáng)性,方能確診為MRSA

MRSA的治療和預(yù)防MRSA的治療萬(wàn)古霉素是目前臨床上治療MRSA唯一療效肯定的抗生素NCCLS規(guī)定：萬(wàn)古霉素敏感≤4μg/ml，中介8～16μg/ml，耐藥≥32μg/ml，MRSA的治療和預(yù)防萬(wàn)古霉素一種三環(huán)糖肽類抗菌藥物，它和細(xì)菌中的另一種分子（細(xì)胞壁肽聚糖前體五肽）結(jié)合而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白合成，和破壞細(xì)胞膜及阻礙細(xì)菌RNA合成的多種作用，因此使用萬(wàn)古霉素仍然可以殺死MRSA。但是濫用萬(wàn)古霉素則會(huì)產(chǎn)生別的抗藥病菌，最常見的是耐萬(wàn)古霉素腸球菌

MRSA的治療和預(yù)防隨著萬(wàn)古霉素的廣泛使用，也許不久也會(huì)出現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素的MRSA，因此現(xiàn)在就必須適量地慎用萬(wàn)古霉素除萬(wàn)古霉素外，還有壁霉素、香豆霉素等新藥對(duì)MRSA有較強(qiáng)的抗菌活性。另外，萬(wàn)古霉素也可與磷霉素、利福平、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物合用，加強(qiáng)治療效果MRSA的治療和預(yù)防自2002年美國(guó)報(bào)道了第1株耐萬(wàn)古霉素的金黃色葡萄球菌以來(lái),先后出現(xiàn)3株VRSA。我國(guó)尚無(wú)耐萬(wàn)古霉素金葡菌的報(bào)道，如萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA治療無(wú)效,后果將不堪設(shè)想細(xì)菌的抗藥性是不可避免的，但并不是不可以控制的，導(dǎo)致超級(jí)病菌流行的重要原因是濫用抗菌藥物。

MRSA的治療和預(yù)防目前臨床濫用抗生素的現(xiàn)象，對(duì)MRSA的流行起了一定的擴(kuò)散作用，第三代頭孢菌素的長(zhǎng)期使用與MRSA的出現(xiàn)率呈平行關(guān)系醫(yī)護(hù)人員檢查病人前后要嚴(yán)格洗手消毒，有條件應(yīng)用一次性口罩、帽子、手套，醫(yī)療用品要固定，以防院內(nèi)交叉感染合理使用抗生素早期檢出帶菌者加強(qiáng)消毒制度醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)對(duì)新入院及MRSA易感者的檢查，尤其是燒傷病區(qū)、ICU、呼吸病房、血液科和小兒科等。同時(shí)細(xì)菌室應(yīng)選用