豬塞尼卡谷病毒的檢測(cè)　重組酶恒溫?cái)U(kuò)增法

豬塞尼卡谷病毒的檢測(cè)重組酶恒溫?cái)U(kuò)增法范圍本文件描述了豬塞尼卡谷病毒（SenecaValleyvirus，SVV）的重組酶恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)（RecombinasePolymeraseAmplification）方法。本文件適用于豬塞尼卡谷病毒的快速檢測(cè)、診斷、檢疫、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?。所用液體試劑均需使用無DNA/RNase的容器進(jìn)行分裝。RNA提取試劑盒：市售。重組酶恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒：市售。水：GB/T6682，一級(jí)。PBS溶液：pH值7.4。稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.27?g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

1.42?g、氯化鈉（NaCl）8?g、氯化鉀（KCl）0.2

g，加滅菌水約800?mL充分?jǐn)嚢枞芙?，加入濃鹽酸調(diào)pH值至7.4，定容至1?000?mL。0.1%DEPC水。1?000?mL水中加1?mLDEPC，放在1?000?mL容量瓶中靜置4?h后備用。重組酶恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物：按附錄A規(guī)定。陽性、陰性對(duì)照。陽性對(duì)照：帶有SVV序列DNA全長的質(zhì)粒。陰性對(duì)照：已知SVV陰性樣本的DNA。儀器設(shè)備熒光定量PCR儀：配有配套反應(yīng)管（板）。支持多通道檢測(cè)。分析天平：精度為1?mg。高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于13?000?g/min。冰箱：2?℃～8?℃和-20?℃以下。酸度計(jì)。電熱恒溫水槽：室溫至100?℃。溫度精度±0.5?℃。渦旋振蕩器。微量移液器：10?μL、20?μL、100?μL、1?000?μL。離心管：1.5?mL。無DNase和RNase。試驗(yàn)步驟樣品符合GB19489和NY/T541中關(guān)于實(shí)驗(yàn)室生物安全和獸醫(yī)診斷樣品的采集和保存的要求。樣品采集棉拭子樣品無菌采集豬口鼻棉拭子。組織樣品按照NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、在運(yùn)抵檢測(cè)地點(diǎn)前的樣品保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范確定的規(guī)程，無菌采集病死豬的淋巴結(jié)、脾、胸腺、腸粘膜和肺等組織樣品。樣品的保存2?℃～8?℃不超過24?h，-20?℃以下不超過3個(gè)月，-70?℃以下不超過10年。樣品處理棉拭子樣品處理方法口鼻拭子管6?000?g/min震蕩45?s，取200?μL進(jìn)行RNA提取。淋巴結(jié)、脾、胸腺等組織樣品處理取0.05?g（±0.01?g）組織塊放入盛有500?μLPBS緩沖液的研磨管中，6?000?g/min震蕩研磨45?s，制成約10%的組織勻漿液，5?000?g/min離心5?min，取200?μL上清液進(jìn)行RNA提取。RNA的提取按RNA提取試劑盒說明書提取樣品和對(duì)照組的RNA。提取的RNA應(yīng)立即檢測(cè)，否則應(yīng)置于-70?℃凍存。重組酶恒溫核酸擴(kuò)增擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備設(shè)50?μL重組酶恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)液體系見表1。按重組酶恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒說明書配制體系并完成相關(guān)操作。擴(kuò)增反應(yīng)液體系組分用量μL1%DEPC水25.410?μMSVV-F210?μMSVV-R210?μMSVV-Probe0.6模板5恒溫?cái)U(kuò)增試劑15恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)選擇檢測(cè)模式：FAM。將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，做好標(biāo)記。恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件按照表2設(shè)置。恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)溫度39?℃循環(huán)數(shù)40信號(hào)采集每30?s反應(yīng)時(shí)間20?min結(jié)果判定陰性、陽性結(jié)果判定結(jié)果判定見表3。結(jié)果判定序號(hào)通道Ct值結(jié)果判斷1FAMUNDET或40樣本低于檢測(cè)限，報(bào)告為陰性2FAM≤37判定為陽性3FAM37～40復(fù)檢一次，如仍為37～40，則判定為陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照無Ct值或大于37，并且無擴(kuò)增曲線。陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于37，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。如陰性和陽性對(duì)照不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。結(jié)果參考圖譜見附錄B。

（規(guī)范性）

重組酶恒溫核酸擴(kuò)增引物重組酶恒溫核酸擴(kuò)增引物見表A.1。重組酶恒溫核酸擴(kuò)增引物引物序列SVV-F5’-TTCTAAAGCGCAAATTCGTCCAAAACAACGACG-3’SVV-R5’-CCAGAATGTTGAGCCAACATAGAAACAGATTGC-3’SVV-Probe5’-TAAAGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTC（FAM-