第二章 高效液相色譜法課件

2025/1/117高效液相色譜法第二章

高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點(diǎn)二、流程及主要部件三、影響分離的因素四、高效液相色譜法的主要分離類型2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（1）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（2）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（3）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（4）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（5）2025/1/117高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點(diǎn)

特點(diǎn)：高壓、高效、高速高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。2025/1/117高效液相色譜法1．高效液相色譜法與氣相色譜法比較（1）應(yīng)用范圍不同氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；而液相色譜適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70~80%。（2）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，而在氣相色譜中氣體的傳質(zhì)速率要快得多。2025/1/117高效液相色譜法（3）液相色譜能完成難度較高的分離工作

①氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，而在液相色譜中流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。

②液相色譜固定相類型多，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。

③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇，而氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的。（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。2025/1/117高效液相色譜法

2．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。

例如對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.2025/1/117高效液相色譜法小結(jié)綜上所述，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。2025/1/117高效液相色譜法二、流程及主要部件1.流程高壓輸液系統(tǒng)——進(jìn)樣系統(tǒng)——分離系統(tǒng)——檢測(cè)系統(tǒng)——數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2025/1/117高效液相色譜法Agilent1100LC的主要部件2025/1/117高效液相色譜法2.主要部件(1)高壓輸液系統(tǒng)主要部件之一，包括貯液裝置、高壓輸液泵、過(guò)濾器、脫氣裝置等

高壓輸液泵壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一?；疽螅簯?yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2025/1/117高效液相色譜法(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2025/1/117高效液相色譜法(3)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，也可配備自動(dòng)進(jìn)樣裝置。其結(jié)構(gòu)如圖所示：2025/1/117高效液相色譜法(4)高效分離系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和流動(dòng)相。色譜柱是其核心部分，柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2025/1/117高效液相色譜法(5)高效液相色譜檢測(cè)器紫外光度檢測(cè)器（UVD）：最小檢測(cè)量10-9g·mL-1，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測(cè)器。2025/1/117高效液相色譜法光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2025/1/117高效液相色譜法（6）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜工作站的功能：色譜參數(shù)的選擇和設(shè)定；自動(dòng)化操作儀器；色譜數(shù)據(jù)的采集和存儲(chǔ)，并作“實(shí)時(shí)”處理；對(duì)采集和存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理；自動(dòng)打印，給出一套完整的色譜分析數(shù)據(jù)和圖譜。同時(shí)也可把一些常用色譜參數(shù)、操作程序，及各種定量計(jì)算方法存入存儲(chǔ)器中，需用時(shí)調(diào)出直接使用。2025/1/117高效液相色譜法2025/1/117高效液相色譜法1.固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。三、影響分離的因素2025/1/117高效液相色譜法2.流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若淋洗液的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2025/1/117高效液相色譜法流動(dòng)相組成流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。2025/1/117高效液相色譜法選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題：（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。2025/1/117高效液相色譜法四、高效液相色譜法的主要分離類型1.吸附色譜（液-固吸附色譜）“液-固色譜法”是利用各組分在固定相上吸附能力的不同而將它們分離的方法。以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）早期通過(guò)在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。2025/1/117高效液相色譜法3.離子交換色譜固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹(shù)脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。

可分離分析：核苷酸、碳水化合物、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、酶等

4.凝膠色譜（空間排阻色譜）按分子尺寸的差異進(jìn)行分離的一種液相色譜方法。以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。2025/1/117高效液相色譜法五、高效液相色譜法的應(yīng)用1.在食品分析中的應(yīng)用1)食品營(yíng)養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等；2)食品添加劑分析：防腐劑、著色劑等；3)食品污染物分析：霉菌毒素等。2.在環(huán)境分析中的應(yīng)用

多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥殘留等。2025/1/117高效液相色譜法五、高效液相色譜法的應(yīng)用

3.在生命科學(xué)中的應(yīng)用

1)低分子量物質(zhì)，如氨基酸、糖類、維生素等的分離和測(cè)定。2)高分子量物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和酶的純化、分離和測(cè)定。4.在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用