DB33T 2272-2020 杭白菊脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程　

DB33Technicalregulationsforvirus-freeplantletsofChrysanthemummorifolium浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布1請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。朱衛(wèi)東、周建松、戴德江、沈子堯、劉輝輝、楊傳寶、2杭白菊脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程CMV）和馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）等的脫毒組培瓶苗、脫毒原種苗及脫毒生產(chǎn)用苗。NY/T401脫毒馬鈴薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T2122-2015進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢3不攜帶本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)病毒的植株數(shù)占所檢測(cè)植株4生產(chǎn)技術(shù)4.1脫毒組培瓶苗4.1.1外植體選擇4.1.2無(wú)菌苗繁育莖段經(jīng)無(wú)菌水清洗后置于超凈工作臺(tái)，切取帶生長(zhǎng)點(diǎn)的面1min后，經(jīng)次氯酸鹽和Tween-無(wú)菌濾紙吸干水分，剝?nèi)?.3mm～0.4.1.3脫毒苗培育4.1.4脫毒苗快繁4.1.5培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度30μmol·m-2·s-1～60μmol·m-2·s-1，白天溫度25℃±2℃,晚上溫度18℃±2℃（黑暗培養(yǎng)）。4.2脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗4.2.1脫毒原種苗生產(chǎn)4.2.1.1基質(zhì)準(zhǔn)備建議基質(zhì)栽培。基質(zhì)配比為泥炭:珍珠巖:蛭石=3:44.2.1.2定植方式4.2.2.1苗床準(zhǔn)備定植前施足基肥，每667m2（畝）施入有機(jī)肥200kg～300kg，有機(jī)肥應(yīng)符合NY525標(biāo)準(zhǔn)，高濃度三元復(fù)合肥15kg。按畦寬1.2m～1.5m，溝寬30cm～35cm，溝深25cm～35cm，4.2.2.2繁殖方式4.2.2.2.1生產(chǎn)用苗的繁殖可以采用扦插繁殖或壓條繁殖。4.2.2.2.2扦插繁殖：脫毒原種苗株高30cm以上時(shí)，用消毒刀具剪取帶有3個(gè)～5個(gè)節(jié)的8cm～10cm莖段，莖段基部扦插于苗床、營(yíng)養(yǎng)缽或穴盤(pán)，栽后澆透水，用遮光率為50%的遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔭，相對(duì)濕度保持75%～90%，等莖段基部發(fā)出根，掀4.2.2.2.3壓條繁殖：苗床上的脫毒原種苗株高40cm～50cm時(shí)4.2.2.2.4脫毒種苗繁育脫毒生產(chǎn)用5分級(jí)與質(zhì)量要求5.1脫毒苗按繁育過(guò)程可分為脫毒組培瓶苗、脫毒原5.2脫毒組培瓶苗按質(zhì)量要求分為優(yōu)質(zhì)苗和合格苗。5.3脫毒組培瓶苗、脫毒種苗的質(zhì)量等級(jí)指標(biāo)、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則參見(jiàn)附錄A。5包裝箱內(nèi)附脫毒苗出廠（圃）合格證，病毒檢測(cè)報(bào)告參見(jiàn)附錄C；外面應(yīng)注運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)控溫控濕，溫度以15℃~25℃為宜，相對(duì)濕度以60%～90%為宜。6脫毒組培瓶苗、脫毒種苗的質(zhì)量要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則A.1質(zhì)量要求A.1.1脫毒組培瓶苗質(zhì)量等級(jí)指標(biāo)A.1.2脫毒種苗質(zhì)量等級(jí)指標(biāo)A.2檢驗(yàn)方法A.3檢驗(yàn)規(guī)則A.3.1組批規(guī)則A.3.2檢驗(yàn)分類7A.3.2.2型式檢驗(yàn)A.4判定原則8煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）。B.2.1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(DAS-E菊花B病毒是單分體線形正義ssRNA病毒。取各編號(hào)植株的葉片，提取總RNA，利用寡聚胸腺嘧啶T-ACCGAATTCTTAGTCACAATGCC段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用T4DNA連接酶與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒，陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序，序列與CVB一致的啶T引物oligo-dT將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用番茄不孕病毒的特異引物（上游引物5’載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒，陽(yáng)性重組質(zhì)煙草花葉病毒是單分體線形正義ssRNA病毒。取各編號(hào)9黃瓜花葉病毒是三分體線形正義ssRNA病毒。取各編號(hào)植株的物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒，陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’和下游引物與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒，陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序，序列與PVY一致電鏡檢測(cè)法主要用于檢測(cè)菊花B病毒、番茄不孕病毒、煙病葉浸蘸負(fù)染色法：用研缽將病葉組織充分研磨，組織汁液經(jīng)1%的磷鎢酸（pH值6.8病葉組織超薄切片法觀察：將病葉片切成1mm2～2mm2小塊，用2.5二十面體，直徑約29nm，負(fù)染可見(jiàn)一個(gè)直徑約12nm的電子屬于植物桿狀病毒科（Virgaviridae）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒顆粒呈剛直的長(zhǎng)桿狀，直徑約為18nm，長(zhǎng)度為300nm～310nm，主要分布在感病植株細(xì)胞質(zhì)及液二十面體，直徑約29nm，負(fù)染可見(jiàn)一個(gè)直徑約12nm的電子屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus為彎曲線狀病毒顆粒，直徑11nm～13nm，長(zhǎng)度為680nm～900nm，分布在感病植株的杭白菊脫毒苗出廠（圃）合格證、杭白菊脫毒苗病毒檢驗(yàn)報(bào)告C.1杭白菊脫毒苗出廠（圃）合格證原種采集地：編號(hào)DB33/T2272—杭白菊脫毒種苗標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)模式圖見(jiàn)圖D.1。正、品質(zhì)優(yōu)良、病蟲(chóng)害的植株。采樣最佳時(shí)間為10月~11月晴天16:00,切取帶生長(zhǎng)點(diǎn)的2cm～3cm莖段。Tween-20消毒8min～10無(wú)菌水沖洗5次～8次，用0.3mm～0.5mm的莖尖分mm～0.5mm的莖經(jīng)病毒檢測(cè)合格的含有1個(gè)～2個(gè)節(jié)間中，每20d～30d繼代1次。繼代控制在4代~6代。有機(jī)肥200kg~300kg,有機(jī)肥應(yīng)符合NY準(zhǔn)，高濃度三元復(fù)合肥15kg。按畦寬1.2m~1.5m,段基部扦插于苗床、營(yíng)養(yǎng)缽或穴盤(pán)，栽后澆透水，用遮光率為50%的遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔭，相對(duì)濕度保持75%～90%,的脫毒原種苗株高40cm～50cm時(shí)，用土塊進(jìn)行"壓條",