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DB33MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusu浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本標準按照GB/T1.1-2009給本標準起草單位：浙江省動物疫病預(yù)防控制中1鴨坦布蘇病毒RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測方法本標準規(guī)定了鴨坦布蘇病毒的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）和實時熒光定量RT-PCR的實驗條鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuVir屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒類、Ntaya病毒群，可引起鴨、鵝產(chǎn)蛋下降，雛鴨、雛鵝發(fā)病2）：液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存，其工作糖完全熔化。待瓊脂糖膠冷至50℃~60℃時，加EB溶液（終濃度0.5μg/mL）或5μL核酸染料，搖3.2.11商品化的一步法實時熒光RT-PCR5'-GCAACCAGGCAAAGAGGT5'-AAGTGAGCCTCATCCATAATDTMUV探針FAM-CCGTCATCCAACATC-4操作步驟與結(jié)果判定4.1樣品采集與處理4.1.1組織器官5.1.1.2取待檢組織樣品適量（0.1g），按1:5倍（W34.1.2.1抗凝血4.1.2.2血清用無菌注射器直接吸取全血，自然凝固，3000r/min離心5mi4.1.3咽拭子、肛拭子用無菌棉簽刮取家禽的咽部或泄殖腔粘膜，放入含0.1MPH7.4PBS的離心管內(nèi)。3000r/min離4.1.4樣品保存制備樣品在冷藏條件不宜超過4h，長期保存應(yīng)放入-4.2.1設(shè)立陽性、陰性樣品對照，陽性對照為滅活的鴨坦布蘇病毒感染a)樣品處理好后，在樣品處理區(qū)，取n+2個1.5mLDEPC處理44.3.1.2反應(yīng)條件4.3.2.1反轉(zhuǎn)錄M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶先加入去離子滅菌水，然后再按照順序逐一加入表5中成分，每一次都應(yīng)加入到液面以下。全部加4.3.2.3反應(yīng)條件54.3.4結(jié)果判定5.3.4.2被檢測樣品擴增出567bp目的條帶，判定為陽性；未擴增出5674.4.1反應(yīng)體系設(shè)立陰性對照和陽性對照，按順序加入表6中的成分。全部加完后，輕輕吹打混勻，500r/min離2×OneStepRT-PCRBTAKARAExTaq?HS(5U/μl)PrimeScript?RTEnzym///4.4.2反應(yīng)條件4.4.3熒光素的設(shè)定ReportDye設(shè)定為FAM，QuencherDye設(shè)定為MGB或4.4.4結(jié)果判定64.4.4.2質(zhì)控標準4.4.4.3結(jié)果描述及判
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