流感病毒的分離技術(shù)操作規(guī)范

流感病毒的分離技術(shù)操作規(guī)范病毒分離培養(yǎng)是流感樣病例病原學(xué)監(jiān)測的基礎(chǔ)，是流感病毒檢測最常用和最可靠的方法之一。目前多采用雞胚和MDCK細胞進行流感病毒分離。通過雞胚分離的流感毒株與原始標本的抗原性和基因特性可能會有所不同，而通過MDCK細胞所分離的流感病毒與原始標本相似。另外由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK細胞對“O”相毒株的敏感性遠高于雞胚，所以MDCK細胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。但是目前全球主要使用雞胚進行流感疫苗生產(chǎn)，MDCK分離的病毒在很多國家尚未批準用于疫苗生產(chǎn)，因此雞胚分離仍然發(fā)揮著舉足輕重的作用。具備流感病毒分離能力的流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室收到哨點醫(yī)院的常規(guī)監(jiān)測標本后，要求利用狀態(tài)良好的MDCK細胞和（或）雞胚進行病毒分離。若同時進行MDCK細胞和雞胚分離，為減少工作量，可先用MDCK細胞對原始標本進行篩選，MDCK細胞病毒分離結(jié)果為陽性后，再將另外一份-70℃或以下溫度保存的原始標本進行雞胚雙腔接種（羊膜腔和尿囊腔），進行病毒分離。（一）實驗室生物安全級別和生物安全規(guī)定1.流感病毒分離實驗室生物安全級別：季節(jié)性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二級；高致病性禽流感病毒生物安全三級。2.流感病毒分離實驗室生物安全規(guī)定應(yīng)當遵守生物安全實驗室的有關(guān)生物安全的規(guī)定。（二）流感病毒的細胞分離標準操作規(guī)程（所列試劑生產(chǎn)廠家及貨號僅供參考）1.試驗材料剛75-90％成片的MDCK細胞，T-25細胞瓶TPCK處理胰酶（牛胰腺來源Ⅷ型）（SIGMAT8802）HEPES緩沖液,1M母液D-MEM培養(yǎng)基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's液青、鏈霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000μg/mL硫酸鏈霉素)牛血清白蛋白組分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCOCatNo15260）處理好的臨床標本0.5mL（標本處理參見附件1第一部分）無菌移液管：1mL和10mL2.培養(yǎng)基和試劑的準備（建議：經(jīng)常檢查試劑的有效期）500mLD-MEM液中加入：青、鏈霉素母液5mL(終濃度達：100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)牛血清白蛋白組分V12.5mL(終濃度:0.25％)HEPES緩沖液12.5mL(終濃度:25mM)加入7.5%NaHCO310-15mL（終濃度：2-3%)病毒生長液：再向上述培養(yǎng)液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液濃度為2mg/mL）使TPCK-胰酶的濃度為2μg/mL。3.流感病毒MDCK細胞分離程序所有有關(guān)流感病毒分離的操作都應(yīng)在相應(yīng)生物安全級別的實驗室中進行，必須遵守生物安全規(guī)定，嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定，做好個人防護要求。75～90％成片細胞的準備用40倍光學(xué)顯微鏡鏡觀察細胞生長狀態(tài)。選擇處于對數(shù)生長期的MDCK細胞用于病毒的分離。輕輕倒出細胞生長液，用10mL的無菌移液管吸6mLpH7.4-7.6的Hank's液清洗細胞3遍。接種于細胞培養(yǎng)瓶用無菌的移液管將清洗細胞的Hank's液從細胞培養(yǎng)瓶中移出。用無菌的移液管吸取500μl臨床樣品置于細胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動數(shù)次，使之均勻鋪于細胞培養(yǎng)瓶底。將步驟2）中的培養(yǎng)瓶放入35℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2h。從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，用10mL的無菌移液管吸取6mLpH7.4-7.6的Hank's液清洗細胞，加入5mL含終濃度2μg/mLTPCK-胰酶的病毒生長液于細胞培養(yǎng)瓶中。放置于35℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細胞病變情況（細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙增大成網(wǎng)狀，細胞核固縮或破裂，嚴重時細胞部分或全部脫落）。細胞培養(yǎng)物的收獲當75％～100％細胞出現(xiàn)病變時進行收獲。即使無細胞病變也應(yīng)該于第7天收獲。進行紅細胞凝集試驗(HA)，用HI方法進行流感病毒的鑒定（具體方法參見附件1：五、紅細胞凝集及紅細胞凝集抑制試驗）。對于HA≤8的細胞分離物,進行10-1～0-3稀釋后，再感染細胞繼續(xù)進行細胞傳代，直至HA≥8時才能利用HI方法進行病毒的鑒定。經(jīng)連續(xù)傳代2次以上，HA<8者，可以用核酸檢測方法鑒定分型。（三）流感病毒雞胚分離標準操作規(guī)程1.試驗材料9～11日齡雞胚照卵燈70％～75％酒精一次性注射器雞蛋開孔器蠟、膠水或膠布10mL試管和試管架10mL移液管無菌鑷子2.流感病毒雞胚分離程序所有有關(guān)病毒分離的操作都應(yīng)遵守生物安全規(guī)定，嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進入生物安全實驗室要求遵循生物安全實驗室的個人防護要求。（1）驗卵用照卵燈檢測雞胚，標記出雞胚的氣室與尿囊腔的界限、胚胎的位置。如果雞胚是死胚、沒有受精、有裂痕、發(fā)育不全或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉。如何判斷雞胚狀態(tài)血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊。胎動：活胚有明顯的自然運動，但是大于14天的胎動則不明顯；死胚無胎動。絨毛尿囊膜發(fā)育界限：血管密布的絨毛尿囊膜與雞胚胎的另一面（卵黃囊）形成明顯的界限。（2）雞胚接種(照視下雙腔接種法)將雞胚的氣室朝上放置在蛋盤上，標記每個雞胚,通常每個樣本接種3個雞胚。用70％～75％酒精消毒雞胚表面，在氣室端鉆孔，開約6x6mm裂口。注射器裝上16號針頭，吸200μL處理過的臨床標本。從裂口中滴入無菌的液體石蠟，然后輕輕晃動雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層（臟層）鋪開大約1cm2面積（石蠟層不可將殼膜內(nèi)層完全覆蓋，會導(dǎo)致死胚），此時在照卵燈下即可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭緩慢刺入胚胎的鄂下胸前，用針頭輕輕撥動下顎及腿，當進入羊膜腔時，能看到雞胚隨著針頭的撥動而動，即可注射100μl臨床標本。將針頭退出至1/2寸長度，將另外100μl臨床標本注入雞胚尿囊腔。用同一注射器和針頭將同一標本依上法接種另外兩枚雞胚。將針頭棄于合適的生物安全裝置中。用消毒過的醫(yī)用膠布封口。33～35℃溫箱培養(yǎng)雞胚2～3天。一般A型流感病毒培養(yǎng)2天，B型流感病毒培養(yǎng)3天，臨床采樣標本通常培養(yǎng)3天。雞胚進行病毒分離培養(yǎng)時，每天檢查雞胚生長情況，24h內(nèi)死亡的雞胚，認為是非特異死亡應(yīng)棄去。（3）雞胚尿囊液和羊水的收獲雞胚在收獲前應(yīng)置4℃過夜或至少放置4h。標記15mL無菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號一致。用70％～75％酒精消毒雞胚頂部。用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10mL吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管或無菌鑷子刺破雞胚羊膜，吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時也可以將3個雞胚的羊水合并。將雞胚收獲液3000rpm離心5min去除血液和細胞。進行紅細胞凝集試驗。沒有紅細胞凝集現(xiàn)象的標本，應(yīng)再進行雞胚盲傳2次（對于“O”相的毒株，需要連續(xù)傳代多次才能具備在雞胚中生長的特性），盲傳后HA滴度仍為陰性的標本，可按有關(guān)生物安全規(guī)定進行處理。對于HA<8的雞胚分離物進行10-1～10-3稀釋后，繼續(xù)進行雞胚傳代，HA≥8時才能利用HI方法進行病毒的鑒定。經(jīng)連續(xù)傳代2次后HA<8者，可以用核酸檢測方法鑒定分型