目前糖生物學(xué)研究方法

目前糖生物學(xué)研究方法一．研究對(duì)象糖生物學(xué)(glycobiology)是研究聚糖及其衍生物的結(jié)構(gòu),化學(xué),生物合成及生物功能的科學(xué)蛋白質(zhì)、核酸和多糖是構(gòu)成生命的三類大分子，蛋白質(zhì)和核酸的研究已經(jīng)是生命科學(xué)中的點(diǎn)問題。糖類的研究一度被人遺忘，只有少數(shù)科學(xué)家在苦苦探索著糖類的奧秘，糖類研究成了生命科學(xué)中的灰姑娘。然而，隨著蛋白質(zhì)和核酸（主要是基因的研究）中更多的奧秘被人類知曉，糖類的重要性也浮出水面，成為了醫(yī)學(xué)研究的“甜蜜之點(diǎn)”，糖類研究這個(gè)“灰姑娘”等來了屬于她自己的馬車?？茖W(xué)家認(rèn)為，糖類的研究將像一個(gè)人見人愛的“甜蘋果”一樣，獲得更多科學(xué)家的青睞，將成為生命科學(xué)研究中的新熱點(diǎn)。二．糖生物學(xué)的起源\o"編輯本段"科學(xué)家把研究生物體內(nèi)多糖的科學(xué)叫做“糖生物學(xué)”，也有人沿襲“基因組學(xué)”和“蛋白質(zhì)組學(xué)”的概念把這們學(xué)科叫做“糖原組學(xué)”。隨著糖生物學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，用于糖生物學(xué)研究的方法和基本技術(shù)，以及把基礎(chǔ)研究所得的成果進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)技術(shù)等方面的研究也倍受重視，“糖工程學(xué)”的興起也是極為自然的了。

各國政府對(duì)糖生物學(xué)研究的支持

1989年日本創(chuàng)刊了《糖科學(xué)與糖工程動(dòng)態(tài)》(TIGG)雜志。同年日本政府科學(xué)技術(shù)廳提出關(guān)于“糖工程基礎(chǔ)與應(yīng)用研究推進(jìn)戰(zhàn)略”的咨詢，經(jīng)過專家評(píng)議后成為詳盡的戰(zhàn)略方案，于1991年由科學(xué)技術(shù)廳、厚生省、農(nóng)林水產(chǎn)省和通商產(chǎn)業(yè)省聯(lián)合實(shí)施“糖工程前沿計(jì)劃”，總投資百億日元。該計(jì)劃包括：糖工程和糖生物學(xué)。后者又分為糖分子生物學(xué)、糖細(xì)胞生物學(xué)。同時(shí)，成立了“糖工程研究協(xié)議會(huì)”作為協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)。這協(xié)議會(huì)編輯出版了專著《糖工程學(xué)》。

美國能源部于1986年資助佐治亞大學(xué)創(chuàng)建了復(fù)合糖類研究中心(CCRC)，建立復(fù)合糖類數(shù)據(jù)庫(CCSD)，相關(guān)的計(jì)算機(jī)計(jì)劃也稱為糖庫計(jì)劃(Carbank

Project)。1990年底已收集了6000個(gè)糖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，1992年增加到9200個(gè)(包含在20000份記錄中)，1992年底有關(guān)的記錄增加到22000份，1996年增加到42000份。1996年一年中增加的數(shù)量為1991年的4倍。歐洲也不甘落后。歐盟1994～1998年的研究計(jì)劃中有一項(xiàng)“歐洲糖類研究開發(fā)網(wǎng)絡(luò)”計(jì)劃(European

Carbohydrate

Plaform)。其目的是攜帶歐洲各國的糖類研究和開發(fā)，以強(qiáng)化歐洲在糖類基礎(chǔ)研究以及將研究成果轉(zhuǎn)化為商品方面與美國、日本的競爭能力。由于美、日、歐三方的重視。近年來在糖類研究方面已取得不少進(jìn)展。研究結(jié)果已確證，糖類作為信息分子在受精、發(fā)生、發(fā)育、分化，神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方面起著重要作用；炎癥和自身免疫疾病、老化、癌細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)換、病原體感染、植物和病原體相互作用、植物與根瘤菌共生等生理和病理過程都有糖類的介導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上，新興的糖生物學(xué)正處在蓬勃發(fā)展的起點(diǎn)。糖生物學(xué)涉及到許多生物學(xué)科，如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等。糖生物學(xué)研究的發(fā)展又推動(dòng)了這些學(xué)科的快速前進(jìn)。21世紀(jì)生命科學(xué)的研究焦點(diǎn)是對(duì)多細(xì)胞生物的高層次生命現(xiàn)象的解釋，因此，對(duì)生物體內(nèi)細(xì)胞識(shí)別和調(diào)控過程的信息分子——糖類的研究是必不可缺的。三.糖生物學(xué)的崛起最近美國每隔二年召開一次“糖工程”會(huì)議。在1993年首屆“糖工程”會(huì)議上，著名的糖生物學(xué)家、會(huì)議的主持人Hart說，生物化學(xué)中最后一個(gè)重大的前沿，糖生物學(xué)的時(shí)代正在加速來臨。在第2屆會(huì)議時(shí)，又說，糖生物學(xué)是生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)交叉點(diǎn)的前沿。1996年在米蘭召開的第18屆國際糖化學(xué)討論會(huì)上，vonBoeckel等報(bào)告合成了肝素中抗凝活性碎片——五糖的模擬物，其活性是天然產(chǎn)物的2倍，因此，他獲得了以糖化學(xué)先驅(qū)Whistler命名的獎(jiǎng)項(xiàng)。自1991年《結(jié)構(gòu)生物學(xué)當(dāng)代見解》雜志(CurrentOpiniononStructureBiology)創(chuàng)刊以來，每年的第5期上都有“糖類和糖復(fù)合物”為題的專輯。1995年的主編Feizi為專輯加了個(gè)副標(biāo)題“寡糖配體和糖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的時(shí)代已經(jīng)來臨”。這預(yù)示了一個(gè)新的轉(zhuǎn)變：前幾年是以選凝素和細(xì)胞粘附分子等糖結(jié)合蛋白為主角；而今則是這些蛋白質(zhì)的配體寡糖鏈粉墨登場，真正的糖類分子將在舞臺(tái)上扮演主角。1997年在蘇黎士召開的第14屆糖復(fù)合物國際年會(huì)上，Hart因他的發(fā)現(xiàn)而獲獎(jiǎng)，就他們的發(fā)現(xiàn)作了專題報(bào)告。報(bào)告的內(nèi)容以綜述的形式登載于1997年的《生化年評(píng)》上。他和同工作者發(fā)現(xiàn)了在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)特有的O-GlcNAc糖基化。這種糖基化僅在核質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)上接上單個(gè)O-GlcNAc，但可以發(fā)生這種修飾的蛋白質(zhì)非常廣泛，包括核孔蛋白、RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子、染色體蛋白。而且這種糖基化是可逆的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，可以和磷酸化發(fā)生置換。這些結(jié)果均提示，O-GlcNAc糖基化具有和蛋白質(zhì)磷酸化相似的生物學(xué)意義。在第14屆糖復(fù)合物年會(huì)上，還出現(xiàn)了“免疫糖生物學(xué)”、“神經(jīng)糖生物學(xué)”和“植物糖生物學(xué)”等新的分支學(xué)科，新的前沿領(lǐng)域。1998年5月于德國召開“國際糖生物工程討論會(huì)”。這次討論會(huì)下設(shè)3個(gè)分支：(1)糖生物學(xué)，包括糖蛋白和糖脂合成的分子生物學(xué)、糖基轉(zhuǎn)移酶的分子生物學(xué)、細(xì)胞內(nèi)的通路和投送受體、分化發(fā)育和基因治療、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)、寄主和病原體的相互作用、糖基化和疾??；(2)糖化學(xué)，涉及的內(nèi)容有化學(xué)合成、組合合成、酶法合成、分子相互作用和結(jié)構(gòu)分析、數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)；(3)糖生物工程，有關(guān)的方面為：發(fā)展糖藥物的重組工具、表達(dá)系統(tǒng)、宿主和載體、宿主細(xì)胞的糖基化工程、糖蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)、生物工程工序、藥理學(xué)和診斷、重組和天然糖蛋白的糖信號(hào)及其在體內(nèi)的命運(yùn)和靶向性、質(zhì)控和分子技術(shù)、法規(guī)條例。一些發(fā)展中國家也給予糖生物學(xué)以一定的重視，并競相主辦國際性會(huì)議。1997年在愛爾蘭的Galway曾召開過皇家化學(xué)學(xué)會(huì)糖類春季討論會(huì)，并計(jì)劃在1999年召開第10屆歐洲糖討論會(huì)。1997年在波蘭華沙召開了鞘糖脂和鞘氨醇的結(jié)構(gòu)、代謝和功能的國際討論會(huì)。1999年1月印度在Bangalore主辦第5屆國際真核細(xì)胞表面生物大分子生物功能討論會(huì)。四．糖生物學(xué)的研究對(duì)象及方法（1）多糖的提取方法：中性鹽溶液提取法、水解酶消化提取法、蛋白酶水解法。（2）多糖的分離純化：目前，有關(guān)寡糖分離純化的方法有很多，有活性炭柱色譜法，纖維柱色譜法，硅膠柱色譜法，葡聚糖凝膠色譜法，陰離子交換色譜法以及高效液相色譜法等。其中高效液相色譜法作為重要的分離技術(shù)，具有分離效率高，分析速度快的和適用范圍廣等特點(diǎn)，被認(rèn)為是迄今為止人類掌握的對(duì)復(fù)雜混合物分離能力最佳的手段之一。用于糖類物質(zhì)分離的高效液相色譜法主要有以下幾種分離模式。2-1陰離子交換色譜法陰離子交換色譜法的原理是：糖分子的pKa值通常在12—14之間，呈弱酸性，再強(qiáng)堿性流動(dòng)相中會(huì)部分或全部以陰離子形式存在，能在陰離子交換柱上被保留并得到分離；分離后的糖鏈可直接進(jìn)入脈沖安培檢測器被檢測。這種糖類物質(zhì)無須衍生化和復(fù)雜的樣品處理過程，具有快速，微量，高效，選擇性好，靈敏度高等特點(diǎn)，是分析中性或酸性糖鏈混合物良好的工具。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)運(yùn)于生化，醫(yī)藥衛(wèi)生，食品，飲料等樣品中單糖，二糖，低寡聚糖，糖醇和氨基糖等的分析。但該法存在的缺點(diǎn)用強(qiáng)堿性溶液作為洗脫劑的缺點(diǎn)是用強(qiáng)堿性溶液作為洗脫液會(huì)引起糖鏈的差相異構(gòu)和降解；同時(shí)分離后的糖鏈含有大量的無機(jī)鹽，而系統(tǒng)又沒有脫鹽步驟。因此用該方法得到的樣品不能直接用于后續(xù)的質(zhì)譜分析。親水作用色譜親水作用色譜是一種以強(qiáng)親水性的極性吸附劑作為固定相，以高比例有機(jī)相／低比例水相緩沖液作為流動(dòng)相，用來分離極性和親水性化合物的液相色譜模式。是反相液相色譜的重要補(bǔ)充。在親水作用色譜中，流動(dòng)相中的水是強(qiáng)的洗脫劑，乙腈或異丙醇往往被作為弱洗脫劑；固定相常使用硅膠，氨基，等正相色譜填料或者特殊設(shè)計(jì)的表面含有極性基團(tuán)的親水作用色譜專用填料如酰胺基，聚琥珀酰亞胺及其衍生物等。親水作用色譜在糖鏈分析中具有最好的選擇性，是寡糖分離的理想色譜模式。多孔石墨化碳色譜小粒徑的多孔石墨化碳由六方形排列，共價(jià)結(jié)合的碳原子層構(gòu)成，層與層之間由范德華力聯(lián)系，表面結(jié)構(gòu)均勻，穩(wěn)定性好，可耐受的pH范圍為1—14.與傳統(tǒng)的反相色譜填料相比，石墨化碳表面具有奇特的極性增強(qiáng)效應(yīng)以及在某些條件下較強(qiáng)的疏水性，因此被用于極性很強(qiáng)的物質(zhì)分析。與陰離子交換柱分離原理不同的是：多孔石墨化碳色譜柱的保留機(jī)制不僅基于填充劑與樣品間的疏水作用，而且還包括電子受體-供體之間的誘導(dǎo)電荷偶極作用力具有較大的色譜柱容量，小粒徑的多孔石墨化碳與糖鏈之間的極性相互作用對(duì)糖鏈的保留較強(qiáng)，大大提高了糖鏈分離的選擇性，非常適合于寡糖的制備性操作。而且洗脫時(shí)只要用易于除去的水溶性有機(jī)溶劑即可。由于糖的親水性強(qiáng)，常規(guī)的反相高效液相色譜柱分離時(shí)需要進(jìn)行衍生化，操作復(fù)雜；而小粒徑的多孔石墨化碳柱對(duì)非衍生化的寡糖和帶有少量氨基酸殘基的糖肽都能獲得良好的分離效果，而且特別對(duì)唾液酸化糖鏈的分離具有很好的選擇性。因此可用于糖鏈異構(gòu)體和唾液酸化糖鏈的分析。但由于該法的重見性和穩(wěn)定性相對(duì)較差，在一定程度上限制了其成為糖鏈分離的常規(guī)方法。2—4柱前衍生-反相高效液相色譜：該法對(duì)糖鏈的衍生化有還原端的衍生化和非還原端的衍生化。反相高校液相色譜是高效液相色譜中最常用的分離模式，然而天然糖類物質(zhì)卻因極性較大，難以直接在常規(guī)的反相柱上實(shí)現(xiàn)分離。加之盡管上述高效液相色譜的多模式分離能力能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜化合物糖鏈的分離純化，但因糖類物質(zhì)缺乏明顯的光學(xué)活性基團(tuán)，無法滿足柱后高靈敏度光學(xué)檢測的需要，使分離后糖鏈的后續(xù)檢測成為困難。盡管安培，示差，蒸發(fā)光散射等檢測器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖類的檢測，但在儀器的兼容性，檢測靈敏度以及糖鏈?zhǔn)栈氐确矫鎿Q不能滿足要求。為了解決這一矛盾，糖鏈的柱前衍生化起到了至關(guān)重要的作用。在糖鏈進(jìn)入色譜柱分離之前先將其與具有紫外或熒光活性的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，使糖鏈帶上熒光或熒光基團(tuán)，滿足光學(xué)檢測的要求；由于用于標(biāo)記的紫外或熒光物質(zhì)一般具有較強(qiáng)的疏水性，因而衍生物很容易在常規(guī)的反相色譜柱上保留，實(shí)現(xiàn)分離。五、多糖分析與結(jié)構(gòu)鑒定無論對(duì)多糖，寡糖還是糖蛋白上的糖鏈分子，對(duì)其進(jìn)行分析與鑒定都是很困難的工作，這方面技術(shù)手段的欠缺也在很長時(shí)間內(nèi)影響了糖生物學(xué)與糖生物工程的發(fā)展，是其遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后與核酸與蛋白工程的原因。但隨著生物化學(xué)，分析化學(xué)等科學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在，解析糖的結(jié)構(gòu)已經(jīng)不在是令人望而生畏的工作，通過多種技術(shù)手段的整合，即使針對(duì)復(fù)雜的混合樣品，也可以完成結(jié)構(gòu)鑒定工作。以下是多種糖分析技術(shù)及基于質(zhì)譜的糖結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)。3—1糖分析技術(shù)（1樣品的前處理前處理是進(jìn)行糖結(jié)構(gòu)研究的必須手段，用于糖結(jié)構(gòu)研究樣品的前處理方法主要有水溶液提取，親脂性有機(jī)溶劑的提取，從而得到水溶性，脂溶性和不溶性的三大類型的分子。水溶的部分所包含的含糖類物質(zhì)最多，其中有糖蛋白，蛋白聚糖，簡單的多糖，以及多種多樣的小分子糖苷類物質(zhì)等。脂溶的部分中主要的含糖組分是糖脂和一些小分子糖苷。而水溶性和脂溶性的部分，如果依據(jù)分子量，它們又可分為幾個(gè)級(jí)分。水溶性如果可以分為大，中，小三個(gè)很粗的級(jí)分外；而脂溶性部分一般僅中和小三個(gè)級(jí)分，因?yàn)橐话愕奶侵肿恿慷疾皇呛艽蟮?。糖組在某種意義上也可以歸屬為代謝物組，因此，水溶性和脂溶性的小分子更多的作為代謝物組的研究對(duì)象。（2色譜高效液相色譜是目前廣泛使用的技術(shù)，因此，分析一個(gè)糖組是最常用的方法莫過于高效液相色譜，對(duì)糖鏈鑒定的二維高效液相色譜圖譜法已經(jīng)普遍使用。可是，傳統(tǒng)的二維高效液相色譜圖譜法鑒定的樣品是純的糖鏈，按照該方法的常規(guī)操作，是對(duì)純的糖鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記，并經(jīng)過兩種不同的色譜柱，分別得到兩個(gè)出峰時(shí)間，由出峰時(shí)間確定樣品的結(jié)構(gòu)。而糖組研究的是一個(gè)組織，細(xì)胞和體液中的所有N—糖鏈樣品，雖然經(jīng)無水肼處理，可以很方便地得到一組由樣品中糖蛋白上降解下來的N—糖鏈，但是無法使用金典的高效液相色譜圖譜法。如果使用串聯(lián)的多維色譜可以解決這樣的問題。（3電泳（3.1如果不是用于樣品制備，電泳在糖組分析上和色譜一樣，是非常有用的工具。一些糖蛋白簡單的糖型，可以用毛細(xì)管電泳加以鑒定。除此之外，還有利用高效毛細(xì)管電泳在兩種不同的緩沖系統(tǒng)中，測定多種N—糖鏈的遷移率，并且也制作了和二維高效液相色譜圖一樣的二維毛細(xì)管電泳圖譜。同樣，二維毛細(xì)管電泳圖譜可以對(duì)一些純的糖鏈樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。除非利用串聯(lián)的毛細(xì)管電泳，否則一般的毛細(xì)管電泳在糖組研究中，不能達(dá)到高通量，快速分離的目的。（3．2、熒光輔助糖電泳原理和核酸的凝膠電泳的原理相似，除去了N—糖鏈和O—糖鏈外側(cè)的唾液酸后，這些糖鏈基本上是中性的，如果利用帶有氨基的酸性染料，與糖鏈還原端的醛基反應(yīng)，就可以使糖鏈帶有熒光的同時(shí)，也具有強(qiáng)的酸性。但該法也有一定的缺點(diǎn)，通常只能知道個(gè)組分的大小，，而不能知道關(guān)于糖鏈的更多信息。（3.3二維凝膠電泳以等電點(diǎn)聚焦和SDS—凝膠電泳相結(jié)合的二維凝膠電泳，雖然不能檢測完整的糖組，但是在研究糖蛋白組時(shí)，仍是很有用的，在常規(guī)染色后得到的二維凝膠電泳圖譜中，如果發(fā)現(xiàn)一串分子量相近的電泳行為不同的顯色斑點(diǎn)，這就提示了這些斑點(diǎn)很有可能是一組肽鏈結(jié)構(gòu)相同或相似的蛋白質(zhì)經(jīng)修飾后產(chǎn)生的復(fù)合性蛋白質(zhì)。在諸多的復(fù)合蛋白質(zhì)中，最常見的又是糖蛋白。因此，對(duì)這樣的一組顯色斑點(diǎn)的深入極有可能提供有關(guān)糖蛋白組的信息。如果在得到了二維凝膠電泳圖譜后，不是使用常規(guī)的考馬斯亮蘭進(jìn)行染色，而是利用特異的用熒光標(biāo)記的凝集素進(jìn)行類似與傳統(tǒng)的組織化學(xué)染色的過程，則可以得到更多的信息。凡是能被凝集素先顯色的斑點(diǎn)都是糖蛋白，再根據(jù)不同凝集素染色的結(jié)果，可以推測不同的斑點(diǎn)可能含有的糖鏈結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些結(jié)果，可以有目的地對(duì)二維凝膠電泳圖譜中的斑點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的糖蛋白組的研究。(3.4親和色譜親和色譜在糖類研究中占有重要的地位，以為在自然界中存在著一大類被稱為凝集素的糖類結(jié)合蛋白。凝集素和糖類的相互作用，猶如抗體與抗原的作用。因此，在糖類的分離和純化，以及研究糖類和糖綴合物中糖部分的結(jié)構(gòu)與功能時(shí)凝集素是經(jīng)常使用的工具。早年在分離和鑒定糖蛋白和糖鏈時(shí)，曾使用了系列親和色譜技術(shù)。其基本原理是，在自然界中存在著各種各樣的凝集素，它們有各自不同的糖結(jié)合專一性，因此，分別將糖類專一性不同的幾種凝集素固定化，然后，