DB37T-動物疫病鑒別檢測技術(shù) 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群草案報(bào)批稿

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB37/TXXXX—XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)定起草。本文件是DB37/TXXXX《動物疫病鑒別檢測技術(shù)》的第3部分。DB37/TXXXX已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒；——第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型；——第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。引言動物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的臨床病癥具有一定程度的相似性，同時(shí)，有些疫病弱毒疫苗的使用干擾了病原的檢測。動物疫病鑒別檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立，規(guī)定了對不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鑒別檢測，為山東省動物疫病精準(zhǔn)防控提供了技術(shù)支持，對于促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。禽腺病毒（Avianadenovirus）分為3個(gè)屬：禽腺病毒屬（Aviadenovirus）、唾液腺病毒屬（Siadenovirus）和腺胸腺病毒屬（Atadenovirus）。禽腺病毒Ⅰ群包括A～E5個(gè)種12個(gè)血清型（FAdV-1～8a、8b～11）為禽腺病毒屬成員，感染雞、火雞、鴨、鵝、鴿子以及珍珠雞、雉雞、鸚鵡、鴕鳥等野生禽類并引起心包積水綜合征、包涵體肝炎、壞死性胰腺炎和肌胃糜爛癥以及呼吸道疾病等典型臨床病癥；禽腺病毒Ⅱ群為唾液腺病毒屬，成員包括火雞出血性腸炎病毒、雉雞大理石脾病毒、雞脾腫大病毒等，其中火雞出血性腸炎病毒主要危害火雞養(yǎng)殖；禽腺病毒Ⅲ群唯一成員減蛋綜合征病毒（Eggdropsyndromevirus,EDSV），又稱為鴨腺病毒A種，為腺胸腺病毒屬，該病毒來源于鴨，易感宿主包括雞、鴨、鵝等禽類，導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降及產(chǎn)色淺、殼薄和無殼蛋，也可引起雛鵝呼吸道病征。我國養(yǎng)禽業(yè)主要包括雞、鴨、鵝、鴿子等，禽腺病毒Ⅰ群和Ⅲ群易感宿主均包括雞、鴨、鵝等，是影響我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要病原，且二者具有部分相同群抗原，因此，有必要針對禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群開展鑒別檢測，對于精準(zhǔn)防控禽腺病毒感染具有重要意義?！秳游镆卟¤b別檢測技術(shù)》擬由三個(gè)部分構(gòu)成：第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒。目的在于規(guī)范豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在豬瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型。目的在于規(guī)范兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在兔瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。目的在于規(guī)范禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。動物疫病鑒別檢測技術(shù)第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群范圍本文件描述了禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction,PCR）的鑒別檢測方法。本文件適用于含有禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群的鑒別檢測。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682?分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541?獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范DB63/T1652病害動物及病害動物產(chǎn)品無害化處理技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。試驗(yàn)原理PCR技術(shù)是在TaqDNA聚合酶作用下，以靶DNA為模板、靶DNA序列5'端與3'端互補(bǔ)的且長度一般為18?bp～27?bp的特異性寡核苷酸為引物、dNTP為反應(yīng)原料，按照堿基配對及半保留復(fù)制原理，經(jīng)變性、退火、延伸循環(huán)多次，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)型上升，并通過瓊脂凝膠電泳獲知擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量從而判定結(jié)果。本文件對禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分子量差異，用于禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群的鑒別檢測。試劑或材料除非另有說明，所用試劑均為分析純。水：GB/T6682，一級。10?000×核酸熒光染料（GelRed/GelGreen）。DL?2?000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)：包括100?bp、250?bp、500?bp、750?bp、1?000?bp、2?000?bp分子量標(biāo)準(zhǔn)。PCR反應(yīng)試劑：10×Taq?DNA聚合酶緩沖液、Taq?DNA聚合酶（5?U/μL）、dNTP（2.5?mmol/L）；2×?PCR反應(yīng)預(yù)混液（2×Taq?PCR?Mix）。磷酸鹽緩沖液（PBS）：按照附錄A中的A.1配制。0.5?mol/L?EDTA溶液（pH8.0）：按照附錄A中的A.2配制。1×TAE緩沖液：按照附錄A中的A.4配制。1.5?%瓊脂糖凝膠：按照附錄A中的A.5配制。6×核酸電泳加樣緩沖液：按照附錄A中的A.6配制。病毒DNA提取試劑盒。無核酸酶離心管（1.5?mL）。PCR檢測反應(yīng)管（0.2?mL）。禽腺病毒Ⅰ群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV陽性對照樣品和陰性對照樣品，均-20?℃保存。陽性對照：禽腺病毒Ⅰ群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV基因組DNA；陰性對照：SPF雞肝臟組織。引物：引物名稱和序列按照附錄B中的B.1。儀器設(shè)備Ⅱ級生物安全柜A型。電子天平：精度0.01?g。高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12?000?r/min。微型低速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速6?000?r/min。冰箱：-20?℃。PCR檢測儀。凝膠成像儀。電泳儀、電泳槽。高壓滅菌鍋。樣品樣品采集、保存和運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行。試驗(yàn)步驟樣品處理肝臟組織樣品在Ⅱ級生物安全柜A型中處理。使用電子天平稱取1.00?g?±?0.05?g樣品，剪碎后與?PBS按1:5（W/V）比例混合，研磨成組織勻漿，裝入?1.5?mL無核酸酶離心管，置于高速冷凍離心機(jī)，4?℃、12?000?r/min離心5?min，取上清液提取核酸。拭子樣品置于500?μL的PBS中充分震蕩浸潤，反復(fù)擠壓拭子3次，4?℃、5?000?r/min離心5?min，取上清液提取核酸。病毒培養(yǎng)物樣品收獲的病毒細(xì)胞培養(yǎng)液、禽胚尿囊液或卵黃液，直接提取核酸。陰性對照樣品處理同8.1.1。檢畢樣品按照DB63/T1652處理。核酸提取按照病毒DNA提取試劑盒說明書，提取待檢樣品、陰性對照樣品的DNA。提取的DNA樣品應(yīng)立即檢測，否則應(yīng)-20?℃冰箱保存30?d。PCR檢測反應(yīng)體系配置PCR檢測反應(yīng)體系見表1。也可使用等效的商品化2×PCR反應(yīng)預(yù)混液配制PCR擴(kuò)增體系。表1?PCR檢測反應(yīng)體系PCR反應(yīng)液組分1個(gè)檢測反應(yīng)體系的使用量μL10×Taq?DNA聚合酶緩沖液2.52.5?mM?dNTP0.5禽腺病毒Ⅰ群上游引物（10?μmol/L）1.0禽腺病毒Ⅰ群下游引物（10?μmol/L）1.0禽腺病毒Ⅲ群上游引物（10?μmol/L）1.0禽腺病毒Ⅲ群下游引物（10?μmol/L）1.0DNA樣品2.0TaqDNA聚合酶0.5（2.5?U）水15.5總體積25.0加樣將制備的陰性對照與待檢樣品DNA、陽性對照基因組DNA樣品溶液產(chǎn)物各2μL依次分別加入對應(yīng)PCR檢測反應(yīng)管中，扣緊管蓋，混勻后置于微型低速離心機(jī)離心10s。擴(kuò)增PCR檢測儀反應(yīng)程序：——第一階段：94℃預(yù)變性5min；——第二階段：94℃40s，55℃40s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；——第三階段：72℃10min。瓊脂糖凝膠電泳取5?μL擴(kuò)增樣品，與1?μL6×核酸電泳加樣緩沖液混勻（若使用含有染料的PCR預(yù)混液進(jìn)行擴(kuò)增，省略該環(huán)節(jié)），加樣至1.5?%瓊脂糖凝膠樣品孔，置于電泳槽TAE緩沖液中，并設(shè)DL?2?000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)電泳泳道，按照5?V/cm設(shè)置電泳儀電壓，電泳30?min。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀拍攝圖片，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果判定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)滿足以下條件試驗(yàn)有效，否則無效：a）陰性對照無特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b）陽性對照能夠擴(kuò)增禽腺病毒Ⅰ群4型494?bp與禽腺病毒Ⅲ群EDSV?308?bp特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果描述及判定若被檢樣品PCR產(chǎn)物含有大小為494?bp的特異性條帶，則判定為禽腺病毒I群核酸檢測陽性，若被檢樣品PCR產(chǎn)物含有大小為308?bp的特異性條帶，則判定為禽腺病毒Ⅲ群核酸檢測陽性，若被檢樣品PCR產(chǎn)物同時(shí)含有大小分別為494?bp、308?bp的特異性條帶，則判定為禽腺病毒I群、Ⅲ群核酸檢測陽性；若被檢樣品無特異性PCR產(chǎn)物，則判定為禽腺病毒I群、Ⅲ群核酸檢測陰性。電泳圖見附錄C的圖C.1。

（規(guī)范性）試劑配制磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01?mol/L、pH7.4）稱取氯化鈉（NaCl）8.0g、氯化鉀（KCl）0.2g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g，依次溶于800?mL水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，于高壓滅菌鍋121?℃滅菌20?min，4?℃保存。0.5?mol/L?EDTA溶液（pH8.0）稱取EDTA?18.61?g，加滅菌水至80?mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，充分溶解，定容至100?mL，室溫保存。50×TAE?電泳緩沖液稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）242.0g，溶于700?mL無菌水中，依次加入冰醋酸（冰乙酸）57.1?mL、0.5?mol/L?EDTA溶液（pH8.0）100?mL，定容至1000?mL，室溫保存。1×TAE電泳緩沖液取20?mL?50×TAE電泳緩沖液，加滅菌水至1?000?mL，室溫保存。1.5?%瓊脂糖凝膠稱取瓊脂糖1.5?g，放入100?mL?1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至50?℃～60?℃時(shí)，加入10?μL10?000×核酸熒光染料（GelRed/GelGreen），均勻鋪板，厚度為3?mm～5?mm。6×核酸電泳加樣緩沖液稱取EDTA4.4g、溴酚藍(lán)0.25g、二甲苯腈藍(lán)FF0.25g，依次溶于200?mL滅菌水中，加入180?mL甘油，調(diào)pH值至7.0，定容至500?mL，分裝室溫保存。

（規(guī)范性）引物引物名稱和序列見表B.1。表B.1?引物名稱和序列病毒名稱序列名稱序列（5′—3′）禽腺病毒Ⅰ群上游引物GTGGTRTCCATGTTGGT下游引物ATGTACGCYTCCGCCCTC禽腺病毒Ⅲ群上游引物CTGGTGAGTCTAGCTTGTCT下游引物CACAATCAGTAGCAACACC注：引物溶解于DEPC水，濃度為100?μmol/L，-20?℃保存；根據(jù)需要配制10?μmol/L工作液，-20?℃保存。

（資料性）PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖C.1。494494?bp308?bpbp2?0001?0007505002501001234M567891011121314標(biāo)引字母、序號說明：M——DL?2?000?DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1——陰性對照；2——禽腺病毒Ⅰ群陽性對照；3——禽腺病毒Ⅲ群陽性對照；4——禽腺病毒Ⅰ群、Ⅲ群陽性混合樣品；5——禽腺病毒Ⅰ群、Ⅲ群陰性樣品；6——禽腺病毒Ⅰ群A種（1型）臨床樣品；7——禽腺病毒Ⅰ群C種（4型）臨床樣品