熒光定量PCR技術(shù)特點、原理及其應(yīng)用-2

熒光定量PCR技術(shù)特點、原理及其應(yīng)用-23應(yīng)用

由于FQ-PCR具有高靈敏性，高特異性和高精確性的特點，目前，該項技術(shù)已被應(yīng)用于病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個領(lǐng)域。

3.1病原體測定

由于PCR技術(shù)的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進(jìn)行。但由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴(kuò)增即可為陽性結(jié)果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義，因此結(jié)模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問題提供了可能。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。Morris等[3]用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進(jìn)行了研究。測定顯示，可測得的樣品濃度相當(dāng)于每毫升13個基因組。與巢式PCR比較顯示，F(xiàn)Q-PCR有著與巢式PCR相同的敏感性。另外，還對48例臨床丙型肝炎病人血清樣品進(jìn)行了測試，32例樣品兩種檢測方法均為陽性，10例均為陰性；另有6例用兩種方法測定的結(jié)果不一致。該6例樣品又讓第三個實驗室用巢式PCR方法重新測定，其結(jié)果與FQ-PCR測定的結(jié)果一致率為100%。FQ-PCR技術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的同時又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。

與宮頸癌及其癌前病變有關(guān)的人類乳頭瘤病毒（HPV）有多種類型，以HPV-16、18、31、33、35等類型危險性最高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技術(shù)對子宮陰道灌洗標(biāo)本進(jìn)行了研究。

他們發(fā)現(xiàn)，由于熒光探針的應(yīng)用，對各型HPV的檢測變得十分方便和準(zhǔn)確。由于HPV-16的特異引物可以和HPV-66的模板DNA發(fā)生錯配，用一般PCR方法擴(kuò)增時，如有HPV-66存在，即可擴(kuò)增出HPV-66片段而發(fā)生誤診，但是HPV-16特異探針的應(yīng)用使HPV-66在TaqMan系統(tǒng)中不能擴(kuò)增。因此，F(xiàn)Q-PCR對不同亞型的病毒檢測具有高度特異性。同時也發(fā)現(xiàn)FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法檢測不到的HPV模板濃度在TaqMan系統(tǒng)中卻可檢測到。對于HPV-16、18、31、33、35類型敏感高達(dá)到每100～1000個細(xì)胞中含有一個拷貝的HPV基因組，平均每300個細(xì)胞中含有一個拷貝的HPV基因組。

以前常規(guī)檢測大腸桿菌的方法，都是采用多種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)分離法，對產(chǎn)志賀氏毒素的大腸桿菌（SLTEC）缺乏特異性，因此這種菌株的檢測又費(fèi)時又困難。后來又有應(yīng)用抗體的免疫學(xué)方法和核酸序列測定的生化方法及以DNA擴(kuò)增為基礎(chǔ)的PCR方法等，都因為繁瑣，需要大量的PCR后處理過程及不能對標(biāo)本定量而受到限制。美國Witham等[5]1996年將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設(shè)計應(yīng)用不同的探針，從而提高了實驗特異性。他們同時還對探針相對于引物的位置、反應(yīng)液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實驗的因素進(jìn)行了優(yōu)化實驗，以提高實驗的準(zhǔn)確性和精確性。由于TaqMan系統(tǒng)可以一次測量96管樣品，還可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，又不需要進(jìn)行電滬及EB染色后處理過程，實際應(yīng)用方便，從而提高了實驗的參考價值和應(yīng)用價值。因此該實驗方法是食品檢測方面的一個突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR技術(shù)用于食品中沙門氏桿菌的檢測研究。

在抗癆治療開始后，結(jié)核病人痰中可持續(xù)存在有結(jié)核桿菌，為了研究結(jié)核病人痰標(biāo)本DNA定量結(jié)果是否與有活力的結(jié)核桿菌數(shù)量相符合并監(jiān)測治療反應(yīng)，1998年美國Desardin等[7]用FQ-PCR和競爭性PCR兩種方法定量檢測治療期間連續(xù)收集的結(jié)核病人痰標(biāo)本，結(jié)果顯示兩種方法有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。痰中結(jié)核桿菌DNA定量結(jié)果與抗酸染色顯微鏡下計數(shù)的結(jié)果一致。

3.2腫瘤研究

意大利Gelmini等[2]用FQ-PCR技術(shù)檢測乳腺癌標(biāo)本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索最佳實驗條件，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在28～31之間時，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們在此條件下擴(kuò)增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。為了檢驗FQ-PCR的準(zhǔn)確性和對不同基因拷貝數(shù)的分辨率，他們將c-erbB-2基因的DNA樣本用正常胎盤DNA做不同倍數(shù)稀釋后進(jìn)行實驗，測得的結(jié)果與期望值高度相關(guān)（r=0.997）。他們將實驗數(shù)據(jù)與Southern印跡結(jié)果和已報告的競爭性PCR結(jié)果比較都顯示高度相關(guān)性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。

1998年法國Bieche等[8]用FQ-PCR測定了108例乳腺癌標(biāo)本。他們選擇擴(kuò)增頻率較高的myc、ccnd1和erbB2基因進(jìn)行擴(kuò)增，在108例標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷貝數(shù)增加，拷貝數(shù)增加的最大值分別為4.6、18.6、15.1。同時他們又將這些數(shù)據(jù)與Southern印跡的結(jié)果進(jìn)行比較，顯示了較好的相關(guān)性。

3.3基因表達(dá)研究

由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。為了探測骨髓基質(zhì)血小板生成因子（TPO）在巨核細(xì)胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等[9]用TaqManEZRT-PCR試劑盒在ABI7700反應(yīng)系統(tǒng)測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞TPOmRNA水平，又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結(jié)果顯示ITP和AA病人TPOmRNA水平明顯升高，而ET病人的TPOmRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后ITP病人TPOmRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關(guān)性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA表達(dá)水平與巨核細(xì)胞計數(shù)也有相關(guān)性。這個實驗對闡明TPO的作用提供了依據(jù)。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技術(shù)對鼠成肌細(xì)胞系C2C12中肌肉調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平及動態(tài)變化進(jìn)行了研究。

3.4免疫組份分析

對免疫T細(xì)胞群體V-β組份進(jìn)行分析是研究健康和疾病免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段，可通過流式細(xì)胞法或RFQ-PCR法來進(jìn)行[11，12]。流式細(xì)胞法是通過對細(xì)胞群體進(jìn)行直接而方便的V-β表達(dá)方面的研究，但需要一整套單克隆抗體和大量細(xì)胞來進(jìn)行染色分析，而且人類V-β特異性抗體尚不完備，因此該方法有許多不便之處。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量細(xì)胞，引物設(shè)計也很方便，而且已有多種定量方法，包括錨式PCR法、半定量PCR法、競爭性PCR法等[13，14]，但都因PCR產(chǎn)物的后處理過程需凝膠電泳、EB染色和光密度測量等既費(fèi)時，又降低了準(zhǔn)確性，還增加了污染機(jī)會，使得FQ-PCR的應(yīng)用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行實驗，從而避免了這些問題，他們在反應(yīng)系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對不同的V-β成份，選用特異的上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，再對反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行處理，即可獲得各個成份的數(shù)據(jù)。

3.5基因突變及多態(tài)性的研究

美國Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技術(shù)對正常痘病毒多態(tài)性進(jìn)行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結(jié)合的引物，并設(shè)計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標(biāo)記后進(jìn)行實驗，順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進(jìn)行鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。

3.6其他方面

日本Isono[17]利用FQ-PCR進(jìn)行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)關(guān)系的研究。他們以核基因Cab作為內(nèi)參照，進(jìn)行葉綠體基因rbc1拷貝數(shù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進(jìn)而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導(dǎo)的葉綠體成熟過程聯(lián)系起來。1998年美國Higgins等