生物化學實驗-PCR實驗

生物化學實驗

——PCR實驗（聚合酶鏈反應）PCR原理PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶鏈式反應，是在短時間內大量擴增特定DNA片段的技術。PCR的起始材料是一個基因或片段的DNA模版，雙鏈DNA分子的互補鏈經加熱后解開，形成單鏈；引物（兩條合成短單鏈DNA，分別與模版DNA的特定序列互補）與互補序列相結合；四種三磷酸脫氧核苷酸（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）存在時，聚合酶從引物處從5至3`端合成互補鏈。多次循環(huán)后，模版DNA序列的含量大大增加，用于研究分析。PCR過程1.變性(denaturation)：一般在92～96℃。模板及新合成的雙鏈DNA都變性成為單鏈，該步驟一般只需30s～lmin。2.退火(annealing)：一般在37～65℃。引物特異地結合到變性后的單鏈DNA上。這一步驟一般需30s～lmin。3.延伸(extension)：溫度一般為72℃，時間為1～2min。DNA聚合酶根據模板的順序，在引物3’端接上一個三磷酸脫氧核苷酸，從而使新合成的互補鏈不斷延伸。PCR產物一般為幾百個堿基對(bp)，長的可達幾十千個堿基對(kb)。如果需要合成長片段則可適當延長時間。上述3步驟為1個PCR循環(huán)，DNA片段就增加1倍。反復循環(huán)反應，DNA分子數呈指數增長，即2n(n為循環(huán)次數)。DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳原理不同大小和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等）有不同的遷移率，可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可染料溴化乙錠（EB）結合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此分析實驗結果。操作步驟（一）凝膠制備瓊脂糖0.8g放入250ml的三角燒杯中，加入100ml1×TAE緩沖液，混勻后，將燒瓶置于電爐上，加熱煮沸，至瓊脂糖完全溶解，冷卻至70℃左右時加入溴化乙錠（10mg/ml）5μl，混勻后，即將凝膠溶液倒入凝膠成形模具，室溫下待凝膠完全凝固。（二）上樣電泳將凝膠板放入電泳槽中，在電泳槽中加入1×TAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。PCR產物管中加入上樣緩沖液，混勻后用加樣器加入凝膠樣品孔中。接通電源，調節(jié)電壓至50~100伏，電泳45分鐘。（三）觀察結果電泳后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察。儀器與器材1、電泳儀2、水平式核酸電泳槽3、紫外凝膠成像儀試劑與材料1、瓊脂糖2、6×點樣緩沖渡：0.25%溴酚蘭、40%蔗糖3、DNA分子量標準：λDNA分子量標準：λDNA/HindⅢ4、50×TAE電泳緩沖液貯存液配方：（50×）每升242gTris57.1ml冰醋酸100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）5、0.8%瓊脂糖：0.8g瓊脂糖用100ml1×TAE沸水浴溶解6、10mg/mlEB

1.0g溴乙錠

100ml三蒸水PCR結果PCR實驗常見失敗原因、對策分析及體系優(yōu)化PCR雖然為一個簡單的實驗，但在實際過程中可能會出現各種問題。產生問題的原因可能來源于以下幾個方面：實驗操作，試劑質量，PCR反應過程中各種試劑的含量，以及反應條件，溫度設置等，本文對各個方面進行了討論，大家遇到問題后可以對號入座的查一下。當然，具體問題的解決還依靠實驗者就可能的原因逐項排除，并不斷的摸索才能徹底解決。假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現非特異性擴增帶PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(9