T-GXAS 717-2024 動(dòng)物鸚鵡熱衣原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

GXASDetectionofAnimal-originChlamydiaI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1動(dòng)物鸚鵡熱衣原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法本文件規(guī)定了動(dòng)物鸚鵡熱衣原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法涉及的術(shù)語(yǔ)和定義、原理、試劑和材料、儀GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格MOMPmajoroutermembrane根據(jù)Cps基因特定序列的保守片段，合成一對(duì)特異性引物和一條特異性的熒探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，探針被酶切降解，使熒光報(bào)2針對(duì)CpsMOMP基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為145bp。引物和探針序列詳見附5.4質(zhì)粒提取試劑盒6.6冰箱：2℃~8℃和-20℃及以下用無菌棉拭子采集喉頭、泄殖腔、眼眶分泌物，浸入1使用真空管（含EDTA抗凝劑）采集動(dòng)物全血2mL～5mL，密封后冷藏，并于24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室立即取適量采集的組織樣品置于組織勻漿器中充分研磨，加入滅菌的0.1mol/LPBS（pH7.4）制備10%組織勻漿液。3000r/min離心10min。取上清液，做好標(biāo)識(shí)，立即進(jìn)行Cps核酸檢測(cè)或-20℃及以下儲(chǔ)39.1核酸提取9.2核酸擴(kuò)增9.2.1擴(kuò)增體系PremixExTaq(ProbeDNA模板9.2.2擴(kuò)增條件），9.3.1陰性對(duì)照采用含有Cps特定基因保守序列的重組質(zhì)粒p-Cps作為陽(yáng)性對(duì)照。重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-Cps制備方法與4FAM-TTACCTATAACGGCTGGAACAACA-B5采用人工合成的方法合成一段含有CpsMOMP基因特定保守靶序列，該靶序列包含本文件5.3中引物受態(tài)細(xì)胞，挑取重組子菌落經(jīng)PCR鑒定正確，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，測(cè)算濃度，即構(gòu)建成重組TCAAGCCCAGCACAATTTGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATAAAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTTACCTATAACGGCTGGAAGAAGCTACAGACACCAAATCAGCTACAATTAAATACCATGAATGGCAAGTAGGCCTCGCCCTGTCTTACAGATTGAATATGCTTGTTCCATATA