儀器分析課件第十八章色譜法導(dǎo)論

第十八章色譜法導(dǎo)論導(dǎo)學(xué)

本章是色譜學(xué)的核心內(nèi)容。了解色譜發(fā)展歷史，理解色譜法的概念、分類及特點；掌握色譜法的分離原理；了解色譜圖常用術(shù)語，重點掌握保留值及其相關(guān)內(nèi)容；色譜理論既是對色譜現(xiàn)象的概括，也是對色譜發(fā)展的指導(dǎo)，塔板理論和速率理論應(yīng)充分理解清楚；實際工作中的分離問題與分離度密不可分，所歸納出的分離度公式是色譜法中最重要的公式，并根據(jù)它可以通過改變一些參數(shù)來控制分離度；掌握定量分析的相關(guān)方法。1概述美國氣相色譜儀HP高壓液相色譜儀國產(chǎn)氣相色譜儀2一、色譜法（chromatography）

俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：

色譜法是一種分離技術(shù)。試樣混合物的分離過程是試樣中各組分在色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。

當(dāng)流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。3色譜法簡史俄國植物學(xué)家Tswett于1901年發(fā)現(xiàn)：利用吸附原理分離植物色素1903年

發(fā)表文章：Onanewcategoryofadsorptionphenomenaandtheir applicationtobiochemicalanalysis1906年

Tswett創(chuàng)立“chromatography”——“色譜法”新名詞1907年

在德國生物會議上第一次向世界公開展示顯現(xiàn)彩色環(huán)帶的柱管1930年

R.Kuhn用色譜柱分離出胡蘿卜素1935年

AdamsandHolmes發(fā)明了離子交換樹脂，進一步發(fā)明了離子色譜1938年

Izmailov發(fā)明薄層色譜1941年

Martin&Synge發(fā)明了液-液分配色譜1944年

Consden,Gordon&Martin發(fā)明紙色譜1952年

Martin&Synge發(fā)明氣-液色譜1953年

Janak發(fā)明氣-固色譜1954年

Ray發(fā)明熱導(dǎo)檢測器1957年

Martin&Golay發(fā)明毛細(xì)管色譜1959年

Porath&Flodin發(fā)明凝膠色譜1960年

液相色譜技術(shù)完善4二、色譜法的分類1、按流動相和固定相所處的狀態(tài)分類超臨界流體色譜法(SFC)

用超臨界狀態(tài)的流體作流動相的色譜法。超臨界狀態(tài)的流體不是一般的氣體或流體,而是臨界壓力和臨界溫度以上高度壓縮的氣體,其密度比一般氣體大得多而與液體相似

,故又稱為“高密度氣相色譜法”52、按固定相的固定方式分類63、按分離過程的機制分類7三、色譜法的特點和應(yīng)用1、分離效能高2、靈敏度高3、分析速度快4、應(yīng)用范圍廣5、色譜法的缺點是對未知物的定性分析比較困難(1)色譜分析廣泛應(yīng)用于極為復(fù)雜的混合物成分分析；(2)液相色譜法，在糖類、氨基酸、農(nóng)藥、染料、貴金屬、有機金屬化合物等方面得到了廣泛的應(yīng)用。(3)色譜分離是一種有效的提純物質(zhì)技術(shù)，用于制備分離，得到高純樣品。(4)色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀已成為研究分子結(jié)構(gòu)的重要手段?！飸?yīng)用范圍廣8色譜分離原理

色譜分離是基于樣品中各組分在兩相間平衡分配的差異。色譜分離過程的兩大特點：

第一、不同組分在通過色譜柱時移動的速度不等（差速遷移），它提供了實現(xiàn)分離的可能性。

第二、各組分分子沿柱子進行擴散分布，即分子分布離散。

色譜基本理論是從微觀分子運動和宏觀分布平衡探討提高分離遷移和降低離散遷移。

色譜基本理論是從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面討論色譜分離問題。9分配系數(shù)和分配比

1、分配系數(shù)K又稱為平衡常數(shù)，是指在一定的溫度和壓力下組分在兩相間達(dá)到分配平衡時，組分在固定相中的濃度Cs與在流動相中的濃度Cm之比，即

K↑溶解度或吸附能力↑，組分在固定相中的量↑，在流動相中的量↓。組分在固定相中滯留的時間越長。

K由組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，只隨柱溫和柱壓而變化，與色譜柱中氣相和液相的體積無關(guān)。如果兩個組分的分配系數(shù)相同，則它們的色譜峰完全重合；分配系數(shù)相差越大，相應(yīng)的色譜峰相距越遠(yuǎn)，分離越好。

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。102、分配比k’

又稱容量因子或容量比，是在一定溫度和壓力下，組分在兩相間達(dá)到分配平衡時，組分在固定相中的質(zhì)量p和在流動相中的質(zhì)量q之比。

（1）分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。（2）分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。（3）分配比可以由實驗測得。k’=tR`/t03、分配系數(shù)與分配比的關(guān)系

Vm——為柱內(nèi)流動相的體積，也稱為柱的死體積：包括固定相顆粒之間和顆粒內(nèi)部空隙中的流動相體積；Vs——為固定相的體積，它指真正參與分配的那部分體積：若固定相是吸附劑、固定液、離子交換劑或凝膠，則分別指吸附表面積、固定液體積、離子交換劑交換容量或凝膠孔容。114、基本保留方程基本保留方程可表示為：

tR=t0(1+k)若載氣流量F0恒定，也可用保留體積表示，則

VR=Vm+KVs這就是色譜基本保留方程。

上式說明，色譜柱確定后，Vm和Vs即為定值。分配系數(shù)不同的各組分具有不同的保留值，因而在色譜圖上有不同位置的色譜峰。12色譜圖及常用術(shù)語

試樣各組分經(jīng)色譜柱分離后，從柱后流出進入檢測器，檢測器將各組分濃度（或質(zhì)量）的變化轉(zhuǎn)換為電壓（或電流）信號。電信號強度隨時間變化的曲線，稱為流出曲線，也叫色譜圖。13一、基線

當(dāng)沒有待測組分進入檢測器時，在實驗操作條件下，反映檢測器噪聲隨時間變化的曲線稱為基線。穩(wěn)定的基線是一條直線。二、峰高

從色譜峰頂點到基線的距離叫峰高。它的平直與否可反應(yīng)出實驗條件的穩(wěn)定情況。噪音：使基線發(fā)生細(xì)小的波動的現(xiàn)象。14拐點間距離的一半，即圖中1/2EF。

峰底寬Wb=4σ，半峰寬=2.354σ。

三、區(qū)域?qū)挾?峰底寬度半峰寬標(biāo)準(zhǔn)偏差)色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，可用于衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學(xué)因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。15

如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線的線性范圍內(nèi)，色譜峰如果對稱，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示：式中：C—不同時間t時某物質(zhì)的濃度，C0—進樣濃度，

tr—保留時間，σ—標(biāo)準(zhǔn)偏差。不對稱因子：在實際的色譜過程中，很少符合高斯分布，而是具有一定的不對稱性。可以定義一個不對稱因子As來定量地表示色譜峰的不對稱程度。16拖尾峰：

當(dāng)As大于1時，色譜峰的形狀是前半部分信號增加快，后半部分信號減少慢。引起峰拖尾的主要原因是溶質(zhì)在固定相中存在吸附作用，因此，拖尾峰也稱為吸附峰。伸舌峰：

當(dāng)As小于1時，色譜峰是前半部分信號增加慢，后半部分信號減小快。因為伸舌峰主要是固定相不能給溶質(zhì)提供足夠數(shù)量合適的作用位置，使一部分溶質(zhì)超過了峰的中心，即產(chǎn)生了超載，所以也稱超載峰。17色譜流出曲線的意義

色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)；色譜保留值——定性依據(jù)；色譜峰高或面積——定量依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾取V柱分離效能評價指標(biāo)；色譜峰間距——固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。18四、保留值保留值是試樣中各組分在色譜柱中滯留時間（retentiontime）的數(shù)值，反映了組分分子與固定相分子間作用力的大小。保留值通常用時間、距離或用將組分帶出色譜柱所需要的流動相體積來表示。保留值是由色譜分離過程中的熱力學(xué)因素所決定的。因此，在一定色譜條件下保留值是特征的，可作為色譜定性的參數(shù)。（一）保留值的定義1、保留時間

（retentiontime）

2、死時間

（deadtime）

3、調(diào)整保留時間

（adjustedretentiontime）

4、保留體積

5、死體積

6、調(diào)整保留體積

19

從進樣開始到色譜峰最大值出現(xiàn)時所需要的時間，稱為保留時間。1、保留時間2、死時間

不被固定相保留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需要的時間稱為死時間。死時間實際上就是流動相流經(jīng)色譜柱所需要的時間。對于同一試樣所有組分死時間都是相同的。3、調(diào)整保留時間組分的保留時間與死時間之差值，即實際上就是組分被固定相滯留的總時間。204、保留體積從進樣開始到色譜峰最大值出現(xiàn)時所通過的流動相的體積，其單位為mL。

式中為流動相平均體積流速，因為液體可以認(rèn)為是不可壓縮的，所以在液相色譜中，即為實測值；而在氣相色譜中，由于氣體可以壓縮，必須根據(jù)色譜柱的工作狀態(tài)，對實驗值進行校正。

5、死體積不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相的體積，可由死時間確定：死體積本意是指色譜柱中未被固定相占據(jù)的空隙體積，也即色譜柱內(nèi)流動相的體積。但在實際測量時，它包括了柱外死體積（色譜儀中的管路和連接頭間的空間以及進樣系統(tǒng)和檢測器的空間）。當(dāng)柱外體積很小時，可以忽略不計。6、調(diào)整保留體積

保留體積減去死體積，即組分停留在固定相時所消耗的流動相體積。

21（二）保留值與平衡常數(shù)K的關(guān)系調(diào)整保留體積與平衡常數(shù)K成正比。推導(dǎo)依據(jù)：

當(dāng)某一組分的色譜峰最高點出現(xiàn)時，說明該組分恰好有一半的量洗脫在體積的流動相中剛好流出柱子，其余一半則仍留在柱內(nèi)，即留在柱內(nèi)的流動相（體積為Vm）與固定相（體積為Vs）中。

（三）保留值與容量因子的關(guān)系

由容量因子與平衡常數(shù)的關(guān)系可得：

分配系數(shù)K與保留時間的關(guān)系為：

tR’=k’tM=KtMVs/Vm

在一定的實驗條件下，組分的調(diào)整保留時間正比于分配系數(shù)K（或分配比k’），K（或k’）越大，組分在色譜柱內(nèi)的保留時間越長。由于分配系數(shù)（或分配比）是由組分的性質(zhì)決定的，因此保留值可用于定性。在填充色譜柱中，選擇不同的固定液及其用量，控制組分在色譜柱上的保留值。22由此可推導(dǎo)：

容量因子是色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，值越大，保留時間越長。

綜上所述，在色譜分析中要使兩組分分離，它們的保留時間t必須不同，而t是由兩組分的K或k’決定，所以待分離組分K或k’不同是色譜分離的先決條件。（四）相對保留值也稱選擇性因子（selectivityfactor）其定義為：標(biāo)志兩個峰在色譜圖上的相對位置，可以方便地從色譜圖上計算。相對保留值越大，越容易分離。如果=1，分離不能實現(xiàn)。只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱內(nèi)徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，在色譜分析中，尤其是GC中廣泛用于定性的依據(jù)！23小結(jié)：色譜基本術(shù)語保留值定性的依據(jù)

死時間tm保留時間tR調(diào)整保留時間t

R死體積Vm保留體積VR調(diào)整保留體積VR相對保留值選擇因子

區(qū)域?qū)挾确宓讓挾萕半峰寬W1/2標(biāo)準(zhǔn)偏差

衡量柱效率和反映色譜操作條件的動力學(xué)因素峰高峰面積定量分析的基礎(chǔ)24色譜法基本理論

色譜峰間距離由分配系數(shù)決定，即與色譜的熱力學(xué)過程有關(guān)；

色譜峰的寬窄由組分在色譜柱內(nèi)的傳質(zhì)和擴散行為決定，即與色譜的動力學(xué)過程有關(guān)。

色譜理論可分為熱力學(xué)及動力學(xué)理論兩方面：熱力學(xué)理論是由相平衡觀點來研究分離過程——塔板理論；

動力學(xué)理論是以動力學(xué)觀點速度來研究各種動力學(xué)因素對柱效的影響——速率理論。25把色譜柱比作分餾塔，引用處理分餾過程的概念和理論來解釋色譜的分離過程。一、塔板理論半經(jīng)驗理論：將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；在每一個塔板上，被分離組分達(dá)到一次分配平衡。塔板理論的假設(shè)：

（1）在每一個平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；這一小段間隔的柱長稱為理論塔板高度。（2）將載氣看作成脈動（間歇）過程；（3）試樣沿色譜柱方向的擴散可忽略；（4）每次分配的分配系數(shù)相同。26

根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下：

★開始時，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5?！锂?dāng)一個板體積（1ΔV）的載氣以脈動形式進入0號板時，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號板上，此時0號板液相（或固相）中ns部分組分及1號板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0.5，其中氣液（或氣固）兩相各為0.25而1號板上所含總量同樣為0.5。氣液（或氣固）相亦各為0.25。★以后每當(dāng)一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時，上述過程就重復(fù)一次(見下表)。2728

流出曲線的形狀和濃度極大的位置按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣液兩相中的總質(zhì)量）見上表。由塔板理論可建立流出曲線方程：

m為組分質(zhì)量，V為任意流動相體積，Vr為保留體積，n為理論塔板數(shù)。當(dāng)V=Vr

時，C值最大，即29由流出曲線方程可推出：而理論塔板高度（H）即：

從上兩式可以看出，色譜峰寬越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。

通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細(xì)管105~106，H＜0.5mm

保留時間越長，W或W1/2越小，色譜峰越窄，理論塔板數(shù)越多，組分在兩相間達(dá)到分配平衡的次數(shù)也越多，分離能力越強，柱效也就越高。30有效理論塔板高度和有效理論塔板數(shù)則：

在實際應(yīng)用中，提出了將除外的有效理論塔板數(shù)作為柱效能指標(biāo)。其計算公式為：

在實際應(yīng)用中，常常出現(xiàn)計算出的n雖然很大，但色譜柱的柱效卻不高，這是由于保留時間tR中包含了死時間t0，而t0并不參加柱內(nèi)的分配過程，因此理論塔板數(shù)和理論塔板高度并不能真實地反映色譜柱分離效能的好壞。為此，提出用有效塔板數(shù)neft

和有效高度Heft評價柱效能的指標(biāo)。31有效理論塔板數(shù)與容量因子的關(guān)系

上式說明了，值越小，就明顯地小于值，值越大，就越接近值。應(yīng)當(dāng)指出，在相同條件下，用不同的值的組分測出的柱效率是不同的。32小結(jié)：塔板理論H理論塔板高度理論塔板數(shù)n由于理論塔板數(shù)n不能真實地反映色譜柱的分離效能，故提出用扣除了死時間影響的有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高度Heff色譜柱長度33塔板理論是一種半經(jīng)驗性的平衡理論用熱力學(xué)的觀點闡明了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置提出了計算和評價柱效的參數(shù)貢獻缺點不能解釋造成譜帶擴張的原因和影響板高的各種因素不能說明同一溶質(zhì)為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)34二、速率理論1、速率方程1956年荷蘭學(xué)者范第姆特（VanDeemter）等人在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學(xué)理論，導(dǎo)出了塔板高度H與載氣線速度的關(guān)系式：

該理論仍然采用塔板高度的概念，但同時考慮到H還取決于同一組分的不同分子在柱中差速遷移過程中所引起的色譜峰擴展程度，將色譜過程與組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程等動力學(xué)因素聯(lián)系起來，從理論上總結(jié)出影響塔板高度的各種因素。35（1）渦流擴散項－A

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。

當(dāng)色譜柱內(nèi)同時起步的組分隨流動相進入色譜柱朝柱口方向移動時，如果固定相顆粒大小及填充不均勻，組分分子穿過這些空隙時碰到大小不一的顆粒而必須不斷改變流動方向，使組分分子在柱內(nèi)形成了紊亂的“渦流”。不同的組分分子所經(jīng)過的路徑長短不一，組分分子或前或后流出色譜柱，造成色譜峰的峰形擴張。采用粒度較細(xì)，顆粒均勻的擔(dān)體，盡量填充均勻可以降低渦流擴散項，降低板高H，提高柱效。36（2）分子擴散項—B

B=2

Dg

a.擴散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差。

b.分子擴散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑

c.擴散系數(shù)：Dg∝（M載氣）-1/2；M載氣↑，B值↓Dg—組分在流動相中的擴散系數(shù)（cm2/s）。

—彎曲因子，亦稱阻礙因子，由于固定相顆粒的存在使擴散受阻。當(dāng)試樣分子以“塞子”的形式進入色譜柱后，隨流動相在柱中前進時，由于存在濃度梯度，組分分子自發(fā)地向前和向后擴散即沿著色譜柱軸向擴散，這種擴散稱為“縱向分子擴散”，結(jié)果使色譜峰擴張，板高H增大。37討論：Dg

隨柱溫升高而增加，隨柱壓降低而減?。涣鲃酉喾肿恿看?，Dg小，即B?。?/p>

u增加，組份停留時間短，縱向擴散??；

對于液相色譜，因Dm

較小，B項可忽略。選擇:

球狀顆粒；大分子量流動相；適當(dāng)增加流速；短柱；低溫。38（3）傳質(zhì)阻力項—Cu組分在氣相和液相兩相間進行反復(fù)分配時，遇到阻力產(chǎn)生。Cu=（Cm+Cs）u式中Cm—流動相傳質(zhì)阻力，指試樣組分從流動相擴散到流動相與固定相界面進行質(zhì)量交換過程中所受到的阻力；Cs—固定相傳質(zhì)阻力，為組分從兩相界面擴散到固定相內(nèi)部達(dá)到分配平衡后又返回到兩項界面時受到的阻力。39采用細(xì)顆粒、增大組分在流動相中的擴散系數(shù)Dm（采用分子量小的流動相，使組分分子在流動相中的擴散系數(shù)增加）、適當(dāng)降低流動相線速度等均可使流動相傳質(zhì)阻力減小。Csu：組分分子從兩相界面擴散到固定液內(nèi)部，在固定液中消耗的時間不同，分配平衡后又返回到兩相界面所需時間不同，使色譜帶展寬：

Cmu：組分分子進入色譜柱后，從流動相擴散到兩相界面需要一定的時間。與擴散經(jīng)過的距離平方成正比，與組分的Dm成反比；而擴散經(jīng)過的路徑?jīng)Q定于固定相顆粒間空隙的大小，即決定于dp的大小。由于組分處在顆?？障堕g的不同位置，因此到達(dá)兩相界面的時間不同，使譜帶展寬。減小液膜厚度df，CS下降。但k又減小。當(dāng)保持固定液含量不變時，可通過增加固定液載體的比表面來降低df。但比表面過大又會因吸附過強使峰拖尾。增加柱溫，可增加組分分子在液相中的擴散系數(shù)DS，但k值也減小，為保持合適CS值，應(yīng)控制柱溫。

401.什么是傳統(tǒng)機械按鍵設(shè)計？傳統(tǒng)的機械按鍵設(shè)計是需要手動按壓按鍵觸動PCBA上的開關(guān)按鍵來實現(xiàn)功能的一種設(shè)計方式。傳統(tǒng)機械按鍵設(shè)計要點：1.合理的選擇按鍵的類型，盡量選擇平頭類的按鍵，以防按鍵下陷。2.開關(guān)按鍵和塑膠按鍵設(shè)計間隙建議留0.05~0.1mm，以防按鍵死鍵。3.要考慮成型工藝，合理計算累積公差，以防按鍵手感不良。傳統(tǒng)機械按鍵結(jié)構(gòu)層圖：按鍵開關(guān)鍵PCBA氣相傳質(zhì)阻力：液相傳質(zhì)阻力：：填充顆粒直徑：組分分子在氣相中的擴散系數(shù)

：載氣平均線速度

：固定相液膜厚度

：組分在液相中擴散系數(shù)

以氣-液色譜為例：42將A、B、C值分別代入色譜板高方程式中：

此方程式稱為范第姆特方程，也叫速率方程。它表明理論塔板高度是引起峰擴展的諸因素對理論塔板高度的貢獻的總和。范式方程對色譜分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義。43vanDeemter方程的H-u曲線流動相傳質(zhì)阻力項分子擴散項渦流擴散項H-u關(guān)系曲線固定相傳質(zhì)阻力項

載氣流速高時：傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速

，柱效

。載氣流速低時：分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速

，柱效

。由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。44在某一流速（最佳線速度）下有一板高的極小值（最小板高），相應(yīng)的柱效最高。LC的最小板高比GC的小一個數(shù)量級以上，（理論上）說明柱效LC比GC高得多，由于LC的最佳流速很小，若使用，則分析時間太長，故實際使用的流速比最佳流速高很多。

對于一定長度的柱子，理論塔板數(shù)越大，板高越小，柱效越高。45粒度越細(xì)，板高越小，受線速度影響亦小。在HPLC分析中采用細(xì)粒作固定相的理論根據(jù)！但顆粒細(xì)導(dǎo)致柱流速慢，當(dāng)采用高壓技術(shù)，才能實現(xiàn)HPLC的分析要求。固定相粒度大小對板高的影響46在其他條件不變的情況下，填料粒度由大變小時，渦流擴散項A變小，縱向擴散項B基本不變，流動相傳質(zhì)阻力項減小，而當(dāng)固定液含量不變時，粒度變小，表面積增大，液膜厚度變小，固定相傳質(zhì)阻力項減小，即C變小，因此可知，最小塔板高度減小，而最佳流速增大47（5）速率理論的要點(1)組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。

（2）通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。482、影響色譜帶展寬的其他因素（1）非線性色譜速率理論比較全面地考慮了兩相中的傳質(zhì)和擴散，但仍假定等溫線是線性的。等溫線是非線性的。等溫線的非線性決定了分配系數(shù)不是常數(shù)，使譜帶的高濃度區(qū)域

(中心附近

)和低濃度區(qū)域

(前沿和尾部

)的分子的移動速率不等，使峰展寬。（2）活性中心的影響由于載體表面不完全惰性，即使涂布少量固定液后，在它表面存在的活性中心

(如酸或堿作用中心)對極性強的組分仍會產(chǎn)生吸附，使這些組分釋放的速度慢于其他分子而造成拖尾。解決辦法是將載體預(yù)處理，除去或減少這些活性中心。49（3）柱外效應(yīng)在色譜柱以外的降低柱分離效率的現(xiàn)象稱為柱外效應(yīng)。造成柱外效應(yīng)的因素有兩類：柱前后死體積和與進樣有關(guān)的技術(shù)。

后者包括進樣速度慢，進樣量大及氣化溫度不夠高等。對組分在兩相中的分配系數(shù)不起任何作用，反而造成譜帶展寬。因此，必須將柱外效應(yīng)抑制到最低程度。改善柱效率的因素：★選擇顆粒較小的均勻填料★★選用較低的柱溫操作★★★降低擔(dān)體表面液層的厚度★★★★選用合適的載氣及載氣流速：流速較小時，分子擴散項成為色譜峰擴張的主要因素，宜用相對分子質(zhì)量較大的載氣；流速較大時，傳質(zhì)項為控制因素，宜用相對分子質(zhì)量較小的載氣。50分離度

色譜分離中的四種情況的討論：①柱效較高，K(分配系數(shù))較大，完全分離；②K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，K較大，但分離的不好；④K小，柱效低，分離效果更差。51一、分離度的定義

分離度（resolution，又稱為解析度、分辨率）是色譜圖中相鄰兩峰分離程度的量度。兩峰間的分離程度受兩峰尖的距離和兩峰峰寬的制約。分離度為相鄰兩峰保留值之差與兩峰寬之和的一半的比值。

為了綜合考慮保留值的差值與峰寬兩方面因素對柱效率的影響，以分離度作為色譜峰的總分離效能指標(biāo)。52

時，峰間距離等于，稱為分離。此時，峰有2%的相互重疊。時，峰間距離等于，稱為分離，峰重疊小于1%，可以認(rèn)為兩峰已經(jīng)完全分開。若值更大，分離效果會更好，但會延長分析時間。

在峰形不對稱或兩峰有重疊時，峰底寬度很難測定，此時可用半峰寬代替峰底寬，并認(rèn)為分子為兩組分保留值之差（由色譜體系熱力學(xué)過程決定）；分母為兩峰寬度之和一半（取決于色譜體系動力學(xué)過程）。53二、分離度公式

分離度概括了色譜過程動力學(xué)和熱力學(xué)特性，是衡量色譜柱分離效能的總指標(biāo)。由上式可知：(1)增加塔板數(shù)可以提高分離度(2)k值的最佳范圍是：1＜k＜10(3)相對保留值α增大，能顯著地提高分離度兩根同種色譜柱的相互關(guān)系式：54三、分離度的最佳化（一）一般要求1、定性分析最低要求：2、用峰高法進行定量分析：3、用測量峰面積法進行定量分析：4、相鄰兩組分的響應(yīng)信號差別越大，所需的分離度值越大。55（二）參數(shù)影響1、分離度與的關(guān)系具有一定相對保留值的物質(zhì)對，分離度R直接和有效塔板數(shù)n有關(guān)，說明有效塔板數(shù)能正確地代表柱效能。R與n的平方根成正比，增加n，可以增加R。降低塔板高度H是增大分離度的有效途徑。

根據(jù)速率理論，提高柱效采用直徑較小，粒度均勻的固定相。均勻地填充色譜柱。分配色譜還需要控制較薄的液膜厚度。

根據(jù)下式可計算出給定分離度下應(yīng)具有的塔板數(shù)：562、分離度與的關(guān)系

分離度與成正比。當(dāng)趨于0時，也趨于0；當(dāng)值增大時，項增大，隨之增大；當(dāng)值太大時，增大對增大的貢獻極小，并且分析時間大大延長，導(dǎo)致譜峰擴展嚴(yán)重，有時甚至造成譜帶檢測的困難。所以應(yīng)將值控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。從分離度、分離時間及對峰的檢測等方面綜合考慮，的最佳值一般控制在2~10之間。57由圖看出：當(dāng)k＞10時，隨容量因子增大，分離度的增長是微乎其微的。一般取k為1～10最宜。對于GC，通過提高溫度，可選擇合適的k值，以改進分離度。而對于LC，只要改變流動相的組成，就能有效地控制k值。它對LC的分離能起到立竿見影的效果如果設(shè)Q=（

n/4）（α-1/α

），那么：R=Q

（k/1+k）583、分離度與的關(guān)系

當(dāng)，時，不能實現(xiàn)分離。但值的微小變化都對有很大影響，因此增大值是改善分離度最有力的手段。

r21（與固定相有關(guān)）增大，可使分離度增大。r21

是由相鄰兩色譜峰的相對位置決定的，決定于固定相和流動相的性質(zhì)。在氣相色譜法中：通過改變固定相來改善r21值（流動相惰性）；在液相色譜法中：通過改變流動相來改善r21值（固定相昂貴）。59色譜柱溫度在色譜分離中所起作用色譜柱溫度在色譜分離中扮演既重要又復(fù)雜的雙重作用。柱溫既是熱力學(xué)因素，又是動力學(xué)因素。（1）組分的分配系數(shù)大小直接由組分的自由能決定（固定相一定），受柱溫控制（對柱溫的變化敏感），因此氣相色譜柱必須置于恒溫箱中操作，以排除環(huán)境溫度變化而引起的干擾；在液相色譜中，分配系數(shù)對柱溫的變化不敏感，可在室溫下操作。（2）柱溫又屬于動力學(xué)因素，可直接引起分子擴散速率（Dm決定）、兩相傳質(zhì)速率（Dm、Ds決定）。Dm和Ds的變化實際上是流動相和固定相黏度變化引起。對氣體而言，溫度上升，黏度上升；對液體而言，溫度上升，黏度下降，但柱溫對兩者的變化率不等價，同時，流動相黏度變化又會引起流動相線速的變化。為獲得良好的分離，選擇柱溫十分重要。要提高分離的選擇性，柱溫宜低些；為提高柱效，柱溫宜高些，兩者是矛盾的，應(yīng)通過實驗條件的選擇，達(dá)到兩者的優(yōu)化，改善分離。為什么氣相色譜柱必須置于恒溫箱中操作，液相色譜可在室溫下操作？60樣品量的影響每一色譜柱的固定相，都有一定的樣品線性容量范圍，在該范圍內(nèi)，進樣量增加，色譜峰高增加，色譜峰區(qū)域?qū)挾群捅Ａ魰r間不變。若樣品量超過線性容量范圍，進樣量增加，容量因子k下降。對于分析分離，為獲得必需的分離度，一般進樣量保持在線性容量范圍以下。色譜柱固定相的樣品容量，決定于固定相的性質(zhì)和用量。61某商品色譜柱有關(guān)說明書內(nèi)容為“SE-54”GC柱，柱效2500，這種表示方法正確嗎？為什么？不正確。該說明書雖給出了所用何種固定相，并標(biāo)明是氣相色譜柱，但是對于柱效的描述是不完整的。根據(jù)范氏方程，影響柱效的因素有擴散系數(shù)、液膜厚度、組分分配比等，特別是不同組分在同一根柱子上的柱效是不相同的。因此，在采用塔板數(shù)評價一根色譜柱的柱效時，必須指明組分、固定相及其含量、流動相及操作條件（柱溫、流速）等。這樣，也有利于購買者按條件重復(fù)試驗，來驗證此柱是否達(dá)到該柱效。62

例1：如果柱長L2為1m時，分離度為0.8，要實現(xiàn)完全分離(R＝1.5)，色譜柱Ll至少應(yīng)有多長?63例2：用3m長的填充柱得到如圖所示的色譜流出曲線，為了得到R＝1.5的分離度，填充柱最短需要多少米?64例3：已知一色譜柱在某溫度下的速率方程的A=0.08cm；B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳線速度u和最小塔板高H。

解：欲求u最佳和H最小,要對速率方程微分,即

dH/du＝d(A+B/u+Cu)/du

＝-B/u2+C＝0

而,最佳線速:u最佳＝(B/C)1/2

最小板高:H最?。紸+2(BC)1/2

可得u最佳＝(0.65/0.003)1/2＝14.7cm/sH最?。?.08+2(0.65×0.003)1/2＝0.1683cm65色譜定性和定量分析一、定性分析（一）利用純物質(zhì)對照定性（二）相對保留值法（三）加入已知物增加峰高法（四）保留指數(shù)定性法（五）其它方法如紅外光譜法（IR）、質(zhì)譜法（MS）、核磁共振波譜法（NMR）等結(jié)合進行定性鑒定。66（一）利用純物質(zhì)對照定性

在一定色譜條件下，一個未知物只有一個確定的保留時間。將已知純物質(zhì)在相同條件下的保留時間與未知物保留時間進行比較，就可定性鑒定。相同，未知物可能是已知的純物質(zhì)；不同，未知物就不是該純物質(zhì)。

純物質(zhì)對照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡單，且有純物質(zhì)的未知物。是氣相色譜定性中最常用的定性方法。

由于兩種組分在同一色譜柱上可能有相同的保留值，只用一根色譜定性，結(jié)果不可靠?？刹捎昧硪桓鶚O性不同的色譜柱進行定性，比較未知組分和已知純物質(zhì)在兩根色譜柱上的保留值，如果都具有相同的保留值，即可認(rèn)為未知組分與已知純物質(zhì)為同一種物質(zhì)。67（二）相對保留值法

對于一些組成比較簡單的已知范圍的混合物或無已知物時，可選定一基準(zhǔn)物按文獻報道的色譜條件進行實驗，計算兩組分的相對保留值：

并與文獻值比較，若二者相同，則可認(rèn)為是同一物質(zhì)。（ris僅隨固定液及柱溫變化而變化。）可選用易于得到的純品，而且與被分析組分的保留值相近的物質(zhì)作基準(zhǔn)物。

（三）加入已知物增加峰高法

當(dāng)未知樣品中組分較多，所得色譜過密，不易辨認(rèn)時，或僅作未知樣品指定項目分析時均可用此法。首先作出未知樣品的色譜圖，然后在未知樣品中加入某已知物，又得一色譜圖。峰高的增加的組分即可能為這種已知物。

68（四）保留指數(shù)定性法

保留指數(shù)（retentionindex）又稱柯瓦指數(shù)。它表示物質(zhì)在固定液上的保留值行為，是國際上公認(rèn)的定性指針。重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小。保留指數(shù)的物理意義在于：它是與被測物質(zhì)具有相同調(diào)整保留時間的假想的正構(gòu)烷烴的碳數(shù)乘以100。保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實驗條件無關(guān)。其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。69

IX為待測組分的保留指數(shù)，z與z+n為正構(gòu)烷烴對的碳數(shù)。規(guī)定正己烷、正庚烷及正辛烷等的保留指數(shù)為600、700、800，其它類推。在有關(guān)文獻給定的操作條件下，將選定的標(biāo)準(zhǔn)和待測組分混合后進行色譜實驗（要求被測組分的保留值在兩個相鄰的正構(gòu)烷烴的保留值之間）。由上式計算則待測組分X的保留指數(shù)IX，再與文獻值對照，即可定性。70例：在15%OV-17柱上(柱溫105℃)測得甲烷tM=3.0mm，正壬烷的tR=30mm，正癸烷的tR=58mm；與峰寬相同，均等于4.8mm。求能與達(dá)到基線分離的組分的保留指數(shù)應(yīng)為多少？解：未知組分定位于與出峰，由先求出i組分調(diào)整保留時間值故可得71二、定量分析

式中為被測組分i的質(zhì)量，為被測組分i的峰面積，為被測組分i的校正因子。

（一）峰面積的測量1、峰高乘半峰寬法

當(dāng)峰形對稱，即流出曲線呈高斯正

態(tài)分布時，理論上已證明峰面積A為

2、峰高乘平均峰寬法

不對稱峰面積可以用峰高乘平均峰寬法來計算峰面積。在峰高0.15及