微生物生理學(xué)幻燈片(第五章)

第五章微生物的氮代謝

一、生物固氮

固氮作用——使氮氣作為氮源而利用的過程，是某些原核生物的一種特性。人工固氮——高溫高壓（300-600℃，200-800atm）生物固氮——固氮酶的參與下進(jìn)行，常溫常壓，厭氧條件下。生物固氮的優(yōu)點：經(jīng)濟(jì)（無需投入）；無污染（水體的富營養(yǎng)化、致癌、溫室效應(yīng)、臭氧層的破壞）固氮微生物種類（生態(tài)類型）1894年，維諾格拉斯基——巴氏梭菌Beijerinck（貝哲林克）——根瘤菌屬、固氮菌屬。自生固氮菌——指一類不依賴與它種生物共生而獨立進(jìn)行固氮的微生物。共生固氮菌——指必須與它種生物共生在一起時才能進(jìn)行固氮的微生物。聯(lián)合固氮菌——指必須生活在植物根際、葉面或動物腸道等處才能進(jìn)行固氮的微生物。地球上各種類型的固氮量生物固氮量非生物固氮量固氮類型已固定的氮（×106t/年）固氮類型已固定的氮（×106t/年）生物固氮量175非生物固氮量80其中：農(nóng)業(yè)其中：豆科植物35閃電10非豆科植物燃燒20水稻4其他5工業(yè)方面永久草地45化肥生產(chǎn)40森林和林地40工業(yè)利用10荒地10海洋36全球固氮作用255×106（一）、研究方法

Ahsby（阿什貝）培養(yǎng)基——無氮培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)判斷（不嚴(yán)格、不準(zhǔn)確、不精細(xì)？）。乙炔還原法——利用固氮酶可以催化乙炔形成乙烯，通過氣相色譜儀檢測乙烯的形成及量，從而確定固氮酶的存在、活性、活力。同位素示蹤法（15N，無放射性）——質(zhì)譜分光光度計測出。Ahsby無氮培養(yǎng)基甘露醇（蔗糖、葡萄糖）10gKH2PO40.2gMgSO4.7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4.2H2O0.1gCaCO35g蒸餾水1000mL乙炔還原法測定固氮酶活性

實驗開始時（時間為0）結(jié)果顯示無C2H4存在，但隨著實驗檢測過程的繼續(xù)，C2H4產(chǎn)物增加。

注意：C2H2如何消耗和C2H4是如何增加的過程。如果瓶中含有酶的提取物，條件應(yīng)該是厭氧，即使固氮酶來源于好氧細(xì)菌，也是如此。㈡、生物固氮機(jī)理

1、固氮酶2、能量供給（ATP的供應(yīng)）3、還原力[H]及其傳遞載體4、固氮酶催化的反應(yīng)5、固氮酶的防氧保護(hù)機(jī)制6、固氮產(chǎn)物氨的同化7、固氮酶的調(diào)節(jié)1、固氮酶固氮酶是一種復(fù)合蛋白，由固二氮酶（固氮酶，Dinitrogenase）和固二氮酶還原酶（固氮酶還原酶，Dinitrogenase

reductase）組成。兩種（酶）蛋白成分中都含有鐵（硫鐵蛋白成分），而固氮酶中還含有鉬。含有一個鉬原子、鐵原子（7個？）和硫原子（9個？），是一種小肽，稱為鐵鉬因子（FeMo-co）。N2的還原反應(yīng)在Fe-Mo中心進(jìn)行。FeMo-co的成分是MoFe7S9（MoFe7S8）+高檸檬酸，而且每分子固氮酶存在兩個FeMo-co。作為固氮酶中的鐵鉬輔因子FeMo-co的結(jié)構(gòu)圖左邊部分為與鉬相結(jié)合的Fe7S8方形體（Fe7S9方形體）。鉬又與高檸檬酸上的氧原子相連接，以及固氮酶上的N和S原子相連。每個固氮酶含有兩分子的FeMo-co輔助因子固氮酶兩個組分的比較比較項目固二氮酶（組分Ⅰ）固二氮酶還原酶（組分Ⅱ）蛋白亞基數(shù)4（2大2?。?（相同）相對分子質(zhì)量22萬左右6萬左右Fe原子數(shù)30（24~32）4不穩(wěn)態(tài)S原子數(shù)28（20~32）4Mo原子數(shù)20Cys的SH基32~3412活性中心鐵鉬輔因子（FeMoCo）電子活化中心（Fe4S4）功能絡(luò)合、活化和還原N2傳遞電子到組分Ⅰ上對O2敏感性較敏感極敏感特殊說明一些固氮細(xì)菌在某些生長條件下能合成無鉬的固氮酶，形成所謂互生固氮酶，其不含有鉬，而是含有釩（和鐵）或只是有鐵。當(dāng)鉬充足時，互生固氮酶不能合成，因為含鉬固氮酶是細(xì)胞中主要的固氮酶，推測互生固氮酶是在環(huán)境中缺少鉬時仍可進(jìn)行固氮作用的一種后備酶。2、能量供給（ATP的供應(yīng)）N三N叁鍵解離能為940kJ，O2為493kJ。N2：ATP=1：18~24（不成比例），由呼吸、光合磷酸化或厭氧呼吸、發(fā)酵作用提供。大約每轉(zhuǎn)移2個e-需要水解4~5個ATP。生物固氮也是一個耗能過程，固定1kg氮化合物要消耗10kg碳水化合物，豆科植物光合作用獲得的能量約有5~10%用于固氮。3、還原力[H]及其傳遞載體固氮反應(yīng)中所需大量還原力（N：[H]=1：8）必須以NAD（P）H2的形式提供。由各種碳源物質(zhì)的分解、光合作用的光反應(yīng)中心Ⅱ使水光解、還原性物質(zhì)（機(jī)體外——連二硫酸鈉、丙酮酸等）固氮酶中電子轉(zhuǎn)移的順序如下：電子供體→固氮酶還原酶→固氮酶→N2→2NH3。電子傳遞載體有鐵氧還蛋白（Fd）或黃素氧還蛋白（Fld）。用于氮還原作用的電子從鐵氧還蛋白或黃素蛋白的低電位的鐵硫蛋白上轉(zhuǎn)移到固氮酶還原酶上。固氮酶為得到較低的電位也需要ATP，以便N2的還原。固氮酶還原酶的氧化還原電位是-0.30V，而且當(dāng)電子轉(zhuǎn)移給固氮酶和此酶水解ATP時，電位降低到-0.4V。這種復(fù)合體然后與固氮酶相結(jié)合，結(jié)合后的固氮酶成為還原態(tài)，還原態(tài)的固氮酶將N2還原成NH3（反應(yīng)是在FeMo-co中心進(jìn)行）。雖然將N2還原成NH3只需要6個電子，但實際上在整個反應(yīng)過程中要消耗8個電子，有兩個電子以H2的形式損失掉了。固氮酶的電子供體4、固氮酶催化的反應(yīng)（6個環(huán)節(jié)）固氮酶-固氮還原原酶-Mg-ATP復(fù)合物——完整的固氮酶。整個固氮過程主要經(jīng)歷以下幾個環(huán)節(jié)：①由Fd或Fld向氧化型固二氮酶還原酶的鐵原子提供1個電子，使其還原；②還原型的固二氮酶還原酶與ATP-Mg結(jié)合，改變了構(gòu)象；③固氮酶在“FeMo-co”的Mo位點上與分子氮結(jié)合，并與固二氮酶還原酶—Mg-ATP復(fù)合物反應(yīng)，形成一個1：1復(fù)合物，即完整的固氮酶；④在固氮酶分子上，有1個電子從固二氮酶還原酶—Mg-ATP復(fù)合物轉(zhuǎn)移到固二氮酶的鐵原子上，這時固二氮酶還原酶重新轉(zhuǎn)變成氧化態(tài)，同時ATP也就水解成ADP+Pi；⑤通過上述過程連續(xù)6次的運轉(zhuǎn)，才可使固氮酶釋放出2個NH3分子；⑥還原1個N2分子，理論上僅需6個電子，而實際測定卻需8個電子，其中2個消耗在產(chǎn)H2上（有關(guān)原因尚待進(jìn)一步研究）。固氮酶催化的反應(yīng)說明固氮酶除能催化N2→NH3外，還具有催化2H++2e→H2反應(yīng)的氫化酶活性。當(dāng)固氮菌在缺N2環(huán)境下，其固氮酶可將H+全部還原為H2釋放；在有N2環(huán)境下，也只是把75％的還原力[H]去還原N2，而把另外25％的[H]以產(chǎn)H2方式浪費掉了。然而，在大多數(shù)固氮菌中，還存在另一種經(jīng)典的氫化酶（hydrogenase），能將被固氮酶浪費了的分子氫重新激活，以回收一部分還原力[H]和ATP。自生固氮菌固氮的生化途徑（上）及其細(xì)節(jié)（下）5、固氮酶的防氧保護(hù)機(jī)制固氮酶的兩個蛋白組分對氧極其敏感——導(dǎo)致失活（固二氮酶還原酶的半衰期為45s，固二氮酶為10min）（厭氧條件）電子傳遞的要求?已知的大多數(shù)固氮微生物都是好氧菌，其生命活動包括生物固氮所需大量能量都是來自好氧呼吸和非循環(huán)光合磷酸化——能量的保證。都存在著好氧生化反應(yīng)（呼吸）和厭氧生化反應(yīng)（固氮）這兩種表面上似乎水火不相容的矛盾過程——矛盾的解決？實際中好氧性固氮菌在長期進(jìn)化過程中，早已進(jìn)化出適合在不同條件下保護(hù)固氮酶免受氧害的機(jī)制了——相應(yīng)的機(jī)制（介紹3種）。①好氧性自生固氮菌的抗氧保護(hù)機(jī)制呼吸保護(hù)——固氮菌科的菌種，呼吸耗氧——低氧狀態(tài)（微環(huán)境——局限空間）構(gòu)象保護(hù)——高氧分壓時形成無活性但能防止氧失活的特殊構(gòu)象——與耐氧蛋白（鐵硫蛋白Ⅱ）形成復(fù)合物?！S涅蘭德固氮菌、褐球固氮菌②藍(lán)細(xì)菌固氮酶的抗氧保護(hù)機(jī)制分化出特殊的還原性異形胞——厚壁、缺乏光合系統(tǒng)Ⅱ、脫氫酶和氫化酶活性高（還原態(tài)）、SOD活性高（解除氧毒害作用）、高呼吸強(qiáng)度（2倍）——空間的隔離。非異形胞藍(lán)細(xì)菌固氮酶的保護(hù)——光合作用和固氮作用的分隔（時間，織線藍(lán)細(xì)菌屬）、集束狀生長（中央處于厭氧環(huán)境——失去光合系統(tǒng)Ⅱ，束毛藍(lán)細(xì)菌屬）、提高過氧化物酶和SOD的活性（除去有毒過氧化合物，粘球藍(lán)細(xì)菌屬）——時間的隔離。③豆科植物根瘤菌固氮酶的抗氧保護(hù)機(jī)制侵入根毛→侵入線→皮層→分化膨大變形（不能繁殖）——類菌體（形態(tài)變化大，強(qiáng)固氮活性）。具有類菌體周膜——豆血紅蛋白（由血紅素、球蛋白組成，分別由根瘤菌和植物分別合成，F(xiàn)e3+→Fe2+）。功能：維持O2在低而恒定的水平，調(diào)節(jié)類菌體周圍的氧濃度，保證向類菌體不斷地供應(yīng)濃度低而流速大的氧（氣）流——主要以結(jié)合氧存在，從而解決了呼吸強(qiáng)度對ATP的產(chǎn)生和固氮酶的活性的保持之間的矛盾（結(jié)合氧：游離氧=10000：1）6、固氮產(chǎn)物氨的同化與相應(yīng)的酮酸結(jié)合形成各種氨基酸注意：①不是直接傳遞的，而是需要谷氨酸和谷氨酰胺作為載體；②Gln合成酶需要ATP的參與。N2經(jīng)根瘤菌被植物吸收的過程7、固氮酶的調(diào)節(jié)固氮作用的抑制劑（能量、電子、固氮酶）：作用于電子的活化和傳遞階段（金屬螯合劑、巰基化合物、氧化磷酸化和光合磷酸化的解偶聯(lián)劑等）；作用于底物與酶結(jié)合部位——H+、C2H2和N2競爭性抑制（實際上也是固氮酶的作用底物）。①ATP/ADP比率調(diào)節(jié)ATP/ADP高，固氮酶活性增加；ATP/ADP低，固氮酶活性受到抑制。每催化一個分子氮還原成氨要消耗18-24個分子的ATP，相應(yīng)地產(chǎn)生了18-24個ADP，從而導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)ATP／ADP比率的變化。ADP增加，ATP/ADP比率降低，固氮酶活性受到抑制——固氮作用和固氮酶作用對能量的需要。生命需要維持最低生存水平（生存為第一位）。相關(guān)實驗現(xiàn)象的支持好氧固氮菌在限氧條件下生長時，ATP合成量降低，ATP／ADP比率變小，固氮酶活性降低，向維涅蘭德固氮菌的生長培養(yǎng)基補(bǔ)充氧氣，機(jī)體合成更多的ATP，ATP／ADP比率提高，導(dǎo)致固氮酶活性增加。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)好氧固氮菌ATP合成的速率與固氮酶的活性隨固氮系統(tǒng)中氧濃度的增加而提高（呼吸作用增強(qiáng)）。說明：在固氮菌或胞外固氮系統(tǒng)中ATP／ADP的比率對固氮酶活性有調(diào)節(jié)作用。②氨的調(diào)節(jié)氨效應(yīng)——當(dāng)環(huán)境中存在氨（NH4+）時，出現(xiàn)固氮作用受到抑制的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因：影響固氮酶的合成還是活性，還是二者兼有。3個實驗：證明氨的加入只影響了固氮酶合成，而不直接影響固氮酶的活性（例外：深紅紅螺菌→失活）。證明氨的加入只影響了固氮酶合成的三個實驗A、將有固氮活性的維涅蘭德固氮菌、肺炎克氏桿菌和巴氏梭菌等分別放到含銨鹽的培養(yǎng)基里培養(yǎng)時，在一定的時間內(nèi)固氮菌的固氮活性仍然維持在較高的水平上。說明：看不出是否有影響（？只從實驗中看是沒有影響），但實驗中沒有考慮銨吸收過程需要時間，到達(dá)作用點需要時間，所以實驗證據(jù)不充分——影響和作用不清。B、在莢膜紅假單胞菌和沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液里，固氮酶活性在銨鹽加入后幾分鐘內(nèi)完全被抑制，但經(jīng)過短時間的遲緩期之后固氮酶活性恢復(fù)，遲緩期長短同加入的銨鹽量成正比?！f明銨鹽可以影響到固氮酶的活性，但無法解釋和證明是影響了活性還是酶量；證明氨的加入只影響了固氮酶合成的三個實驗進(jìn)一步實驗同時還發(fā)現(xiàn)從被銨鹽抑制的沼澤紅假單胞菌里提取的固氮酶活性仍然存在——活性得以保持，未受影響；另外還發(fā)現(xiàn)銨鹽加到柱孢魚腥藻的生長培養(yǎng)基里，細(xì)胞內(nèi)ATP含量立即下降40％。——影響到ATP/ADP，使之下降，從而影響到固氮酶活性（間接作用？）。合理的解釋L-谷氨酸+NH4++ATP→L-谷氨酰胺+ADP+Pi對這種現(xiàn)象的解釋是由于谷氨酰胺合成酶活性在銨鹽加入后臨時性增加，造成的現(xiàn)象：①氨吸收加快；②胞內(nèi)ATP因消耗而含量降低。最終結(jié)果：導(dǎo)致胞內(nèi)ATP／ADP比率降低，從而使固氮酶活性迅速降低。C、銨鹽加到以分子氮為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長的固氮菌培養(yǎng)液里，培養(yǎng)一段時間導(dǎo)致固氮菌數(shù)量增加一倍的同時，單位重量的固氮菌固氮活性與銨鹽加入時的固氮活性相比只降低50％。上面的結(jié)果說明：銨鹽在某些固氮菌里不會影響固氮酶的活性（固氮酶的總量不變——總活性不變，單位菌體的固氮酶活性減少）。證明氨的加入只影響了固氮酶合成的三個實驗證明氨的加入只影響了固氮酶合成的3個實驗所說明的問題3個實驗只作為間接的推測結(jié)果；還需要直接結(jié)果的證明。銨鹽的作用——調(diào)節(jié)固氮酶合成針對巴氏梭菌——銨鹽可以通過調(diào)節(jié)固氮酶合成的方式調(diào)節(jié)機(jī)體的固氮作用。實驗過程：①分別以NH4+、NH4+

+氯霉素和N2作為唯一氮源培養(yǎng)固氮菌；②分別測定其培養(yǎng)得到的固氮菌固定15N2的能力。結(jié)果：只有以N2為氮源培養(yǎng)的固氮菌有固氮活性，其他兩種氮源培養(yǎng)的固氮菌無固氮活性。結(jié)論：說明是銨鹽阻遏了固氮酶的合成?！獮槭裁?？銨鹽的作用——調(diào)節(jié)固氮酶合成另外通過研究還發(fā)現(xiàn)在銨鹽耗盡之后，再以N2為氮源培養(yǎng)固氮菌時，短時間內(nèi)胞內(nèi)游離氨基酸的量不增加。這可能是由于氨基酸用于固氮酶合成的結(jié)果；上面的結(jié)果說明：氨的調(diào)節(jié)作用是通過調(diào)節(jié)固氮酶的合成來實現(xiàn)的。其它物質(zhì)對固氮酶的影響在具有硝酸鹽還原酶活性的維涅蘭德固氮菌里，加入硝酸鹽也能使該菌的固氮活性降低50％。硝酸鹽加到缺失硝酸鹽還原酶的菌株里對固氮活性無影響；——說明什么？另外還發(fā)現(xiàn)氨甲酰磷酸在該菌內(nèi)的濃度受固氮系統(tǒng)中NH4+和ATP的控制。而氨甲酰磷酸的調(diào)節(jié)作用可歸因于ATP／ADP和氨的調(diào)節(jié)。

NH4++HCO3-→NH2COO-+H2O（非酶促反應(yīng)）

NH2COO-+ATP→NH2COOPO32-+ADP（Mg2+,氨甲酰磷酸激酶）在研究NH4+的調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn)肺炎克氏桿菌在銨鹽濃度高（大于1.5mmol／L）的培養(yǎng)基上生長時，胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶活性低，而谷氨酸脫氫酶活性高（說明什么？）；在銨鹽缺乏的培養(yǎng)基上生長時谷氨酰胺合成酶活性高，而谷氨酸脫氫酶活性低。說明：NH4+除了對固氮酶的合成有影響外，也對谷氨酰胺合成酶起作用；谷氨酰胺合成酶在固氮酶合成的調(diào)節(jié)上起著重要作用——存在同步影響（可能存在內(nèi)在的聯(lián)系？）。銨鹽存在與否對相關(guān)酶的影響NH4+調(diào)節(jié)固氮酶合成的機(jī)理目前一般認(rèn)為NH4+調(diào)節(jié)固氮酶合成的機(jī)理是：NH4+在谷氨酰胺合成酶催化下與谷氨酸反應(yīng)生成谷氨酰胺，谷氨酰胺可以和谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物（一種調(diào)節(jié)蛋白）相給合導(dǎo)致調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物構(gòu)型發(fā)生變化并結(jié)合到谷氨酰胺合成酶的操縱基因上，阻止谷氨酰胺合成酶結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致谷氨酰胺合成酶不能合成；此時由于沒有谷氨酰胺合成酶，催化固氮酶合成的RNA聚合酶不能轉(zhuǎn)錄固氮酶的結(jié)構(gòu)基因，固氮酶不能合成?！劝滨０泛铣擅傅淖饔?？NH4+調(diào)節(jié)固氮酶合成的機(jī)理當(dāng)胞內(nèi)NH4+缺乏時，谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物無活性，谷氨酰胺合成酶合成，然后它作為一種調(diào)節(jié)因子結(jié)合到固氮酶合成操縱子的啟動基因上，啟動固氮酶的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致固氮酶合成。說明：在銨鹽的調(diào)節(jié)中實際上是谷氨酰胺在起作用（作為固氮酶合成中的調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)著固氮酶合成操縱子上結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄）。在肺炎克氏桿菌的谷氨酰胺缺陷型菌株上得到了證實，因為該缺陷型不能合成固氮酶。固氮酶合成調(diào)節(jié)固氮酶的合成和谷氨酰胺合成酶有關(guān)的實驗證據(jù)增加氨濃度會抑制谷氨酰胺合成酶的合成，同時也影響固氮酶的合成；缺失谷氨酰胺合成酶的谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷型菌株，也不能合成固氮酶；將谷氨酰胺合成酶缺陷菌株與帶有谷氨酰胺合成酶編碼的載體的大腸桿菌進(jìn)行重組，就可以使谷氨酰胺合成酶缺陷的肺炎克雷伯氏菌株恢復(fù)合成固氮酶能力。肺炎克雷伯氏菌的這種重組突變體在通常應(yīng)受到氨抑制的條件下仍能繼續(xù)合成谷氨酰胺合成酶，同時也能合成固氮酶?！獮槭裁?？氨效應(yīng)的生理學(xué)意義氨和氨甲酰磷酸對固氮酶活性的調(diào)節(jié)作用，以及從谷氨酰胺合成酶與固氮酶合成的關(guān)系來看，它們都是微生物的一種自我調(diào)節(jié)，以便適應(yīng)環(huán)境的變化。因為既然環(huán)境中已有充足的NH4+，那么微生物就不必再消耗能量去合成固氮酶，進(jìn)行耗能的固氮作用——節(jié)能。如果菌株缺乏谷氨酰胺合成酶，不能合成谷氨酰胺，因此固氮菌采用不合成固氮酶，以適應(yīng)谷氨酰胺合成酶缺陷的特性，對菌體自身進(jìn)行保護(hù)。否則固氮作用合成的氨沒有去路，過量的氨就會對固氮菌有毒害作用——保護(hù)。氨的“開關(guān)”效應(yīng)在某些固氮菌中，固氮酶的活性也受氨的調(diào)節(jié)，這種現(xiàn)象稱為氨的“開關(guān)”效應(yīng)。在此情況下，過量的氨引起固氮酶還原酶的共價修飾，因而導(dǎo)致酶活性喪失。當(dāng)氨缺乏時，這類修飾蛋白又轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，N2固定反應(yīng)重新開始進(jìn)行。因而氨的開關(guān)作用是一種通過固氮酶來控制ATP消耗速度而又可逆的方法?！罱K的目的是不過度消耗能量，影響到其它生命活動。③鉬調(diào)節(jié)鉬是鐵鉬蛋白與鐵鉬輔因子的重要組成元素，很明顯培養(yǎng)基中鉬存在與否也會影響固氮酶的活性與合成?！荒芎铣桑ǚ窝卓死撞暇┗蚝铣蔁o活性的固氮酶（鮑氏織線藻，當(dāng)加入鉬后可以轉(zhuǎn)化有活性的固氮酶）。實驗證據(jù)（如何證明是何種方式）——固氮活性不受氯霉素抑制，說明鉬元素加入后，不是重新合成固氮酶？④氧調(diào)節(jié)氧能使固氮酶不可逆地失活——確定的結(jié)果。氧對固氮酶作用單靠測定固氮酶活性是不充分的，還得說明氧導(dǎo)致酶活性喪失是否有促進(jìn)了固氮酶的分解和抑制它的合成的過程。用脈沖標(biāo)記和放射自顯影技術(shù)測定14C-氨基酸在有氧條件下是否參與固氮酶合成的實驗來證明。結(jié)果顯示固氮酶多肽中有放射性，說明這種氨基酸參與固氮酶合成——尋找參與合成固氮酶的氨基酸來設(shè)計實驗。將在含NH4+培養(yǎng)基上生長的肺炎克雷伯氏菌接種到無化合態(tài)氮的液體培養(yǎng)基時振蕩培養(yǎng)（對照為不振蕩培養(yǎng)），發(fā)現(xiàn)14C-氨基酸插入到固氮酶中的速率比用氧損傷導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解的速率降低得更快。說明：氧阻遏了固氮酶的合成，但氧調(diào)節(jié)的方式有待進(jìn)一步研究（不充分）。補(bǔ)充：固氮酶基因（nif）——固氮基因群肺炎克雷伯氏菌是一種研究的較深入清楚的固氮生物，其固氮酶和固氮酶還原酶的是復(fù)雜的調(diào)控子中的一部分（大量的操縱子）該調(diào)控子稱為“nif調(diào)控子”；肺炎克雷伯氏菌nif調(diào)控子全長為24kb，并且含有20個基因排列成幾個轉(zhuǎn)錄單位。除了固氮酶結(jié)構(gòu)基因外，F(xiàn)eMoCo基因、控制電子轉(zhuǎn)運蛋白的基因以及一系列調(diào)節(jié)基因亦存在于nif調(diào)控子中。固氮酶是由兩個亞單位組成的復(fù)合蛋白，α亞基(nofD基因產(chǎn)物)和β亞基(nifK基因產(chǎn)物)，每一個亞基都有兩個拷貝。固氮酶還原酶是由兩個相同亞基組成的蛋白二聚體，是nifH的產(chǎn)物。FeMoCo是由幾個基因共同參與合成的，這些基因包括nifN、V、Z、W、E和B。除這些基因外，還有Q基因，用于控制一種產(chǎn)物，此產(chǎn)物涉及到鉬的反應(yīng)過程。nifA基因編碼一種正調(diào)節(jié)蛋白，此調(diào)節(jié)蛋白激活其他nif基因的轉(zhuǎn)錄。肺炎克雷伯氏菌是研究的最清楚的固氮菌

——nif調(diào)控子（調(diào)節(jié)子）的基因結(jié)構(gòu)二、微生物對無機(jī)含氮化合物的代謝㈠、無機(jī)氮代謝的中心環(huán)節(jié)——氨的同化㈡、微生物對氨的同化途徑㈢、影響氨同化的因素㈠、無機(jī)氮代謝的中心環(huán)節(jié)——氨的同化微生物利用無機(jī)氮作為細(xì)胞氮源的能力取決于它是否能夠?qū)⑦@些無機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?。氨的氮原子化學(xué)價為-3，與細(xì)胞有機(jī)物的氮（蛋白質(zhì)、核酸等）處于同一氧化水平，因此許多微生物能夠利用氨以及利用代謝的中間代謝物合成它們所需要的全部氨基酸和其他含氮物，然而微生物所進(jìn)行的氨同化作用的途徑相當(dāng)少。在微生物細(xì)胞所具有的各種氨基酸中，氮只能同化到少數(shù)幾種氨基酸中，然后再由這些氨基酸作為氨基的供體，通過轉(zhuǎn)氨基作用，將氨基轉(zhuǎn)移給酮酸前體并形成相應(yīng)的氨基酸。硝酸鹽——高度氧化的無機(jī)氮源，它可以被許多生物還原，一般分為2類：異化還原作用（NO2-，N2）——反硝化作用；同化還原作用（NH3）。硝酸鹽還原酶（2大類）：

異化型——位于細(xì)胞膜上，誘導(dǎo)酶，氧可阻遏合成和抑制活性；——厭氧環(huán)境

同化型——位于細(xì)胞質(zhì)中，氨阻遏其合成。硝酸鹽還原酶實際上是一種多酶復(fù)合物，該復(fù)合物由脫氫酶、電子傳遞體和硝酸鹽還原酶組成。無機(jī)含氮物的代謝途徑硝酸鹽還原同化還原——硝酸鹽被機(jī)體逐步還原成氨，然后氨被細(xì)胞吸收，用于細(xì)胞物質(zhì)合成。異化還原——硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽或者被分泌到細(xì)胞外，或者進(jìn)一步通過幾步反應(yīng)被還原成分子氮。㈡、微生物對氨的同化途徑氨同化作用的可能途徑是先合成谷氨酸（或谷氨酰胺）、丙氨酸和天冬氨酸、氨甲酰磷酸，然后由這幾種氨基酸作為氨基供體，合成其他氨基酸。主要有5條途徑。氨同化的五條途徑1、谷氨酸脫氫酶（GDH，有兩種：NAD-GDH——分解和NADP-GDH——合成）

α-酮戊二酸+NH4++NADH+H+→L-谷氨酸+NAD+α-酮戊二酸+NH4++NADPH+H+→L-谷氨酸+NADP+2、谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶（glnS-gluS）

L-谷氨酸+NH4++ATP→L-谷氨酰胺+ADP+Piα-酮戊二酸+L-谷氨酰胺+NADPH+H+→2L-谷氨酸+NADP+

谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOG-AT——GlnS）氨的同化作用氨同化的五條途徑3、丙氨酸脫氫酶（ADH）丙酮酸+NH4++NADH+H+→L-丙氨酸+NAD+

丙酮酸+NH4++NADPH+H+→L-丙氨酸+NADP+4、天冬氨酸酶（天冬氨酸酶脫氨酶）延胡索酸+NH4+→L-天冬氨酸5、氨甲酰磷酸合成酶

NH4++HCO3-→NH2COO-+H2O（非酶促反應(yīng)）

NH2COO-+ATP→NH2COOPO32-+ADP（Mg2+,氨甲酰磷酸激酶）注意在各種微生物中，這幾個氨基酸都是轉(zhuǎn)氨基酶反應(yīng)中氨基氮的最活躍的供體。但在許多微生物中，氨同化途徑似乎主要是通過先形成谷氨酸，然后再合成其他氨基酸這條途徑，不過在有些情況下，一些細(xì)菌也可以優(yōu)先利用合成天冬氨酸這條途徑。

㈢、影響氨同化的因素1、培養(yǎng)條件的影響（大腸桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌）——底物的影響（氫供體的影響）氨、葡萄糖——谷氨酸脫氫酶的活性很高（？）氨基酸混合物——天冬氨酸酶活性高，谷氨酸脫氫酶活性低（？）琥珀酸——谷氨酸脫氫酶和天冬氨酸酶的活力幾乎相等（？）2、酶的影響（途徑的取向）NAD-GDH——取向于分解（脫氨基作用）NADP-GDH——取向于合成在一些同時具有NADP-GDH和glnS-gluS的微生物中，當(dāng)氨濃度高時，NADP-GDH起作用，當(dāng)氨濃度低于1毫摩爾/升時，glnS-gluS途徑起作用。三、微生物對有機(jī)含氮化合物的代謝㈠、微生物氨基酸代謝概況

㈡、微生物對核酸的分解代謝及其實際應(yīng)用

㈠、微生物氨基酸代謝概況1、分解及轉(zhuǎn)化（1）氨基酸的脫羧作用（2）氨基酸的脫氨作用（3）氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用

（4）氨基酸消旋作用2、氨基酸的合成（1）氨基酸的脫羧作用脫羧的特點：氨基酸脫羧酶是一類專一性很強(qiáng)的酶；大多數(shù)為誘導(dǎo)酶（只有谷氨酸脫羧酶是組成酶）；磷酸吡哆醛是除組氨酸以外的所有氨基酸脫羧酶的輔酶（組氨酸的輔助因子是丙酮酸，而非輔基）；所有氨基酸脫羧酶所催化的反應(yīng)基本上都是不可逆的。脫羧產(chǎn)物——胺的作用組氨酸——組胺——有降低血壓的作用，胃液分泌的刺激劑。酪氨酸——酪胺——有升高血壓的作用。賴氨酸——尸胺（H2N-(CH2)5-NH2）鳥氨酸——腐胺（H2N-(CH2)4-NH2）合成多胺化合物的前體——精脒（H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2）、精胺（H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，主要存在于真核微生物中），和DNA相結(jié)合（小溝內(nèi)以中和負(fù)電荷）。多胺的功能影響蛋白質(zhì)的合成（大腸桿菌）核糖體的外形會發(fā)生顯著改變（70S——30S少，50S多）——影響和調(diào)節(jié)大分子化合物的合成；缺乏時蛋白合成受阻。改變膜的通透性（具有穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的功能——缺乏，膜通透性增加）。在發(fā)酵后期菌體自溶，氨基酸進(jìn)一步降解，脫羧后生成胺，有臭味產(chǎn)生，在酶制劑生產(chǎn)過程中，即有這種現(xiàn)象。（2）氨基酸的脫氨作用氨基酸失去氨基而生成α-酮酸的過程稱為脫氨基作用①氧化性脫氨基作用

②非氧化性脫氨基作用③氧化-還原脫氨基反應(yīng)（Stickland反應(yīng)）

①氧化性脫氨基作用普遍存在于動物、植物及需氧微生物中在酶的催化下，氨基酸在氧化脫氫的同時釋放游離氨，這一過程稱為氧化脫氨基作用。催化氨基酸氧化脫氨基的酶有兩類：

氨基酸氧化酶氨基酸脫氫酶氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶為需要的黃素蛋白脫氫酶，以FMN或FAD為輔基，脫下的氫可以直接與分子氧結(jié)合生成過氧化氫（不產(chǎn)生ATP？）。在有過氧化氫酶存在時，分解為水和氧。如果沒有過氧化氫酶存在時，H2O2能氧化酮酸，使它脫羧生成低一級的脂肪酸，為非專一性酶。氧化性脫氨基作用（氨基酸氧化酶）

氨基酸脫氫酶是一種不直接需要氧的脫氫酶，它們以NAD或NADP為氫載體，脫下的氫不直接交給氧，而是經(jīng)電子傳遞鏈產(chǎn)生水和能量。氨基酸脫氫酶分布極度廣，動植物與微生物中都有存在，其中最主要的是谷氨酸脫氫酶（GDH），大多微生物具有兩種谷氨酸脫氫酶，即NAD-GDH（分解）和NADP-GDH（合成）。除谷氨酸外，丙氨酸也可以被相應(yīng)的丙氨酸脫氫酶催化生成丙酮酸、NH3和ATP（？）。芽孢桿菌中丙氨酸脫氫酶分布極廣，并且活性較高。從芽孢桿菌中分離到的丙氨酸脫氫酶對NAD+有特異性，它所催化的反應(yīng)要經(jīng)過α-亞氨基中間代謝物階段。在芽孢桿菌中，丙氨酸脫氫酶所催化的反應(yīng)可能是氨同化作用的主要途徑。氧化性脫氨基作用（谷氨酸脫氫酶）氧化性脫氨基作用（丙氨酸脫氫酶）②非氧化性脫氨基作用多存在于厭氧或兼性厭氧微生物中（？）。許多微生物能夠進(jìn)行非氧化性脫氨基作用，其主要作用方式有以下幾種：

還原脫氨基反應(yīng)分解脫氨基反應(yīng)脫水脫氨基反應(yīng)脫硫（巰）氫基脫氨基反應(yīng)還原脫氨基反應(yīng)嚴(yán)格厭氧，利用氫化酶，使氨基酸加氫脫氨生成飽和脂肪酸和氨（大腸桿菌，甘氨酸——乙酸、NH3）。分解脫氨基反應(yīng)反應(yīng)沒有氫的交換，而是分子內(nèi)部發(fā)生氫的轉(zhuǎn)移，氨基酸經(jīng)直接脫氨產(chǎn)生不飽和脂肪酸和氨。（天冬氨酸酶——含氨基酸和低濃度碳水化合物的培養(yǎng)基上，活力最高？，氨同化的逆反應(yīng)——延胡索酸、NH3）。脫水脫氨基反應(yīng)絲氨酸和蘇氨酸脫氨酶（脫水酶）催化，與天冬氨酸反應(yīng)相似，除經(jīng)過β-消去反應(yīng)移去水，產(chǎn)生亞氨基酸外，也出現(xiàn)分子內(nèi)氫的轉(zhuǎn)移。其中第三步反應(yīng)是水與亞氨基的非酶促反應(yīng)釋放氨，5-磷酸吡哆醛是本反應(yīng)的輔助因子。反應(yīng)不可逆。脫硫（巰）氫基脫氨基反應(yīng)半胱氨酸——與脫水脫氨基反應(yīng)相似，但經(jīng)β-消去反應(yīng)移去硫化氫（而不是水），再進(jìn)行分子重排和脫氨反應(yīng)，生成α-酮酸和氨，大腸桿菌、枯草桿菌和酵母菌等都能進(jìn)行這類脫氨基反應(yīng)，反應(yīng)不可逆。③氧化-還原脫氨基反應(yīng)

（Stickland反應(yīng)）在厭氧梭菌屬的一些細(xì)菌能夠進(jìn)行某些氨基酸之間的氧化-還原偶聯(lián)反應(yīng)，以一種氨基酸作底物脫氫（氫供體）進(jìn)行氧化脫氨，而以另一種氨基酸作氫受體進(jìn)行還原脫氨，而實現(xiàn)生物氧化產(chǎn)能的獨特發(fā)酵類型，稱為Stickland反應(yīng)。Stickland反應(yīng)速度非?？?，同時也由于這一反應(yīng)過程中能夠進(jìn)行底物水平磷酸化作用，所以梭菌依靠這一反應(yīng)獲得能源。Stickland反應(yīng)Stickland反應(yīng)中的氫供體和氫受體反應(yīng)必須有一對氨基酸參與反應(yīng)，但并非任意兩種氨基酸之間都能進(jìn)行這種反應(yīng)。有些氨基酸能優(yōu)先作為氫供體，而另一些氨基酸則作為氫受體。對于表中來說，一般作為氫供體的氨基酸能夠與任何一種氨基酸（氫受體）進(jìn)行反應(yīng)。但只有色氨酸和酪氨酸既可作為氫供體，又可以作為氫受體。氫供體氫受體L-丙氨酸L-甘氨酸L-亮氨酸L-脯氨酸L-異亮氨酸L-羥脯氨酸L-纈氨酸L-鳥氨酸L-組氨酸L-精氨酸L-苯丙氨酸L-色氨酸L-色氨酸L-酪氨酸L-酪氨酸L-半胱氨酸L-絲氨酸L-甲硫氨酸（3）氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨酶分布很廣，各種酮酸都能替代其相應(yīng)的氨基酸，供給需要氨基酸的營養(yǎng)缺陷型微生物的生長利用。但這些轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)又不是完全互通的，生物體中有幾組轉(zhuǎn)氨酶（稱為轉(zhuǎn)氨酶A、B和C組），這幾組轉(zhuǎn)氨酶分別只對幾組氨基酸有轉(zhuǎn)氨酶活性，而對另外一些氨基酸則沒有活性。微生物中的幾組轉(zhuǎn)氨酶

微生物中的幾組轉(zhuǎn)氨酶

（具有一定的特異性）A組轉(zhuǎn)氨酶——只能夠催化該組的任一氨基酸與α-酮戊二酸之間的轉(zhuǎn)氨基作用；B組轉(zhuǎn)氨酶——只催化該組氨基酸和相應(yīng)酮酸（非固定）之間的轉(zhuǎn)氨基作用；C組轉(zhuǎn)氨酶——催化纈氨酸和丙氨酸之間的轉(zhuǎn)氨基作用。大腸桿菌中α-酮戊二酸和氨基酸之間的轉(zhuǎn)氨基作用氨基酸野生型菌株細(xì)胞提取物中轉(zhuǎn)氨酶活性A組轉(zhuǎn)氨酶活性（α-酮戊二酸）B組轉(zhuǎn)氨酶活性（B組相應(yīng)酮酸）突變種細(xì)胞提取物中轉(zhuǎn)氨酶活性異亮氨酸400840纈氨酸370580亮氨酸413（100）3甲硫氨酸31103219苯丙氨酸37442629酪氨酸2525618色氨酸7359072天冬氨酸（100）（100）0（100）注：轉(zhuǎn)氨酶活性按照活力最高的底物來表示，并將活力最高的底物的酶活性定為100。（4）氨基酸消旋作用已知一些D-氨基酸是某些微生物（細(xì)菌）細(xì)胞壁和莢膜的組成成分，消旋酶在D-氨基酸的生物合成中起著重要作用。芽孢桿菌屬的一些菌種的多肽類莢膜以及一些含肽抗生素中也發(fā)現(xiàn)有D-氨基酸，所以在這些細(xì)菌中氨基酸消旋酶就很重要（？）。2、氨基酸的合成組成蛋白質(zhì)的20余種氨基酸除可通過轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)合成外；都可以從糖類等物質(zhì)代謝過程中的幾種中間體經(jīng)一系列的生物化學(xué)反應(yīng)合成。在這些氨基酸合成途徑中除賴氨酸在真核生物和原核生物是經(jīng)不同途徑合成外，其余氨基酸合成途徑在這兩類生物中基本上都是相同的，根據(jù)合成氨基酸的前體物質(zhì)類型，可以將氨基酸生物合成為六組。（1）3-磷酸甘油酸族絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸（2）α-酮戊二酸族氨基酸生物合成（谷氨酸族）谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、賴氨酸（真菌）、鳥氨酸（3）草酰乙酸族氨基酸生物合成（天冬氨酸族）天冬氨酸、賴氨酸（細(xì)菌）、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺（4）丙酮酸族氨基酸生物合成丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸（5）芳香族氨基酸生物合成（4-磷酸赤蘚糖、磷酸烯醇式丙酮酸）酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸（6）組氨酸生物合成（5-磷酸核糖焦磷酸+ATP）組氨酸氨基酸生物合成分組核酸的成分組成核酸（DNA、RNA）核苷酸核苷磷酸堿基戊糖㈡、微生物對核酸的分解代謝及其實際應(yīng)用核酸是由許多單核苷酸通過3，5-磷酸二酯鍵連接起來的大分子聚合物。可以通過核酸酶分解利用（營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時），維持生命；核酸不斷地更新