生物反應器校準規(guī)范

PAGE1PAGEII生物反應器校準規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于實驗室用的攪拌式生物反應器的性能參數(shù)的校準，其他中試用生物反應器、光生物反應器、氣升式生物反應器等相關(guān)反應器可參照此規(guī)范執(zhí)行。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件：JJG119實驗室pH（酸度）計JJG291溶解氧測定儀JJG1871磁電式轉(zhuǎn)速傳感器JJF1030恒溫槽技術(shù)性能測試規(guī)范JJF1265生物計量術(shù)語及定義JJF1001通用計量術(shù)語及定義JJF1101環(huán)境試驗設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準規(guī)范凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于該規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。3術(shù)語和計量單位JJF1001－2011、JJF1265－2010中界定的及以下術(shù)語和定義適用于本規(guī)范。3.1生物反應器bioreactor生物反應器一般是指用于進行是進行相應條件下微生物的培養(yǎng)、發(fā)酵，從而獲取活體微生物或其所需的代謝產(chǎn)物的相應生產(chǎn)或?qū)嶒瀮x器。3.2滅菌sterilization用物理或化學的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒蛋白，使之達到無菌保障水平。常用的滅菌方法有化學試劑滅菌（如環(huán)氧乙烷、甲醛等）、射線滅菌（如γ射線、電子束輻射等）、濕熱滅菌、干熱滅菌和過濾除菌等。3.3菌落形成單位colony-formingunit，CFU菌落形成單位是指單位體積樣品在X脂平板上經(jīng)過一定溫度和時間培養(yǎng)后形成的細菌群落總數(shù)，是計算細菌或霉菌數(shù)量的單位。4概述生物反應器一般是指用于進行是進行相應條件下微生物的培養(yǎng)、發(fā)酵，從而獲取活體微生物或其所需的代謝產(chǎn)物的相應生產(chǎn)或?qū)嶒瀮x器。生物反應器類型眾多，本規(guī)范主要針對實驗室使用的攪拌式生物反應器。中試生物反應器或其他類型反應器可參照本規(guī)范的相關(guān)參數(shù)進行校準工作。圖1常用生物反應器示意圖生物反應器是一種利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進行生化反應的裝置系統(tǒng)。它主要通過在封閉或半封閉的無菌環(huán)境容器中，通過合適的技術(shù)手段，針對特定的生物反應過程，對生物反應環(huán)境的溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、溶解氧、氣體流速、壓力等條件進行監(jiān)控，并利用監(jiān)控結(jié)果進行反饋調(diào)節(jié)而控制罐體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而達到在充分利用底物的情況下獲得較高的目標產(chǎn)物的目的。圖1所示為常用的實驗室攪拌式生物反應器的基本結(jié)構(gòu)。攪拌式生物反應器主要由反應器罐體、管路組件、監(jiān)控傳感器及配套的控制單元組成。管路組件包括進樣管、取樣管、進氣管、排氣管等。監(jiān)控傳感器包括溫度傳感器、pH傳感器、溶解氧傳感器以及相應的顯示設(shè)備。配套控制單元包括進樣泵、攪拌電機、恒溫裝置等。目前，大量生物反應器已經(jīng)將監(jiān)控顯示和控制單元等都集成在電腦或控制面板上，便于統(tǒng)一進行設(shè)定、監(jiān)控和聯(lián)動管理。實驗室用生物反應器一般以臺式為主，罐體方便拆卸。部分實驗室也會使用原位生物反應器，這類反應器一般會另外配備原位滅菌系統(tǒng)，便于試驗前后的清洗、滅菌工作。5計量特性生物反應器的計量項目及參考計量性能要求檢表1。表1生物反應器的計量性能指標序號校準項目參考計量性能要求1溫度溫度示值誤差±1.0℃溫度波動度0.5℃2pH*pH示值誤差±0.2pHpH重復性0.1pH3轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速示值誤差±3%4溶解氧*溶解氧濃度示值誤差±0.5mg/L溶解氧濃度重復性0.15mg/L5氣體流量*氣體流量示值誤差±5%6液體流量*液體流量示值誤差±5%液體流量穩(wěn)定性5%7無菌性能測試*無菌落檢出注1：以上技術(shù)指標不適用于合格性判定，僅供參考。計量性能指標也可參照反應器制造廠商給出的技術(shù)要求。注2：*根據(jù)反應器的適用項目，選擇進行項目的校準。6校準條件6.1環(huán)境條件6.1.1供電電源：（220±22）V，（50±1）Hz。6.1.2環(huán)境溫度：（10~30）℃。6.1.3相對濕度：≤85％。6.1.4室內(nèi)應防潮、避光、防熱、無腐蝕性物品，通風良好。6.2校準用標準物質(zhì)及設(shè)備6.2.1溫度計：溫度測量范圍（5.0～50.0）℃，最大允許誤差±0.2℃，精度不低于0.01℃。6.2.2pH有證標準物質(zhì)：應使用經(jīng)政府計量行政部門批準的pH有證標準物質(zhì)。6.2.3光電轉(zhuǎn)速表：轉(zhuǎn)速測量范圍（0~2000）rpm，不確定度不大于3%（k=2）。6.2.4氣體流量計：流量測量范圍（0.3~30）L/min，不確定度不大于3%（k=2）。6.2.5電子天平：實際分度值不大于0.1mg，eq\o\ac（○，Ⅰ）級。6.2.6氣壓表：分度值1hPa，最大允許誤差不超過±2.5hPa。6.2.7秒表：分辨力0.1s，最大允許誤差不超過0.5s/d。6.2.8鼓泡器：多孔。6.2.9亞硫酸鈉（Na2SO3）試劑：分析純。6.2.10二價鈷鹽試劑：分析純。7校準項目和校準方法7.1校準前準備及檢查檢查待校生物反應器銘牌標識是否完好。將待校生物反應器開機預熱，并確定生物反應器各傳感器工作正常。7.2溫度示值誤差設(shè)置反應器溫度在37℃，或根據(jù)實際使用情況設(shè)定一個或多個恒溫溫度點。將反應器的溫度探頭放入反應器內(nèi)，與標準數(shù)字溫度計靠近放置于反應器同一水平面。在設(shè)定的溫度點，同時分別讀取生物反應器溫度示值TR和標準數(shù)字溫度計示值TS，分別讀取三次，取各自的三次平均值為該溫度點的EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R、EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S，按式（1）計算ΔT。ΔT=EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R-EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S（1）式中：EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R——生物反應器的溫度探頭平均值，℃；EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S——標準數(shù)字溫度計示值平均值，℃；ΔT——溫度示值誤差，℃。7.3溫度波動度設(shè)置反應器溫度在37℃，或根據(jù)實際使用情況設(shè)定一個或多個恒溫溫度點。將反應器設(shè)置開啟，使其處于工作狀態(tài)。將標準數(shù)字溫度計插入工作區(qū)域內(nèi)1/2深度位置或反應器溫度探頭位置，在反應器第一次達到設(shè)定溫度后穩(wěn)定至少10min或反應器使用說明書要求的穩(wěn)定時間，開始讀數(shù)。以每分鐘至少6次的均勻間隔讀取示值，持續(xù)10min或反應器使用說明書中規(guī)定的時間。取最大值與最小值的差，換算為溫度值，即為反應器在該溫度點下相應時間間隔內(nèi)的波動度。ΔTf=Tmax-Tmin（2）式中：Tmax——測量期間數(shù)字溫度計最大示值，℃；Tmin——測量期間數(shù)字溫度計最小示值，℃；ΔTf——溫度波動度，℃。7.4pH示值誤差及重復性按儀器操作要求，使儀器處于穩(wěn)定工作狀態(tài)。對待測反應器的酸度（pH）計傳感探頭，用一種標準溶液（對具有兩點校準或多點校準方法的傳感器，應選用兩種或多種溶液校準）校準后，測量另一種標準溶液。測量點可根據(jù)實際常用點進行選擇。進行重復測量操作6次，取平均值作為儀器示值，按式（3）計算該反應器的pH計傳感器示值誤差值ΔpH。測量時應注意溫度平衡及溫度修正。ΔpH=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i-pHS（3）式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i——儀器示值平均值，pH；pHS——pH緩沖溶液標準值，pH；ΔpH——pH示值誤差，pH。取6次儀器示值結(jié)果，按式（4）計算pH重復性結(jié)果SpH。SpH式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i——儀器示值平均值，pH；pHi——單次儀器示值，pH；n——測量次數(shù)，6次；SpH——pH示值重復性，pH。7.5溶解氧濃度測量示值誤差及重復性按操作要求使儀器處于穩(wěn)定工作狀態(tài)。用新配制的無氧水（配制方法見附錄A）對溶解氧探頭進行測試、校準。隨后，根據(jù)實際校準需求，配制準備好飽和溶氧水（配制方法見附錄A），用生物反應器溶解氧傳感器測量飽和溶氧水6次，取其平均值與飽和溶氧水的標準值之差作為該生物反應器的溶解氧示值誤差。若溶解氧傳感器自帶溫度補償功能，則需要在溫度誤差低于±0.2℃情況下進行，否則溶解氧的溫度自動補償不能認可。溶解氧傳感器操作可依據(jù)生物反應器的說明書執(zhí)行，對不進行溶解氧監(jiān)測的反應器可不做此項。ΔC=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)-CS（5）式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)——6次溶解氧測量平均值，mg/L；；CS——溶解氧標準值，mg/L；ΔC——溶解氧示值誤差，mg/L。取6次測量數(shù)據(jù)結(jié)果，按照式（6）計算溶解氧重復性SC。SC式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)——6次溶解氧測量平均值，mg/L；Ci——待測溶液溶解氧的測量值，mg/L；n——測量次數(shù)，6次；SC——溶解氧測量重復性，mg/L。7.6轉(zhuǎn)速示值誤差將反光轉(zhuǎn)速貼片貼于攪拌器旋轉(zhuǎn)葉片或轉(zhuǎn)動軸上，在測量范圍內(nèi)設(shè)置3檔轉(zhuǎn)速，分別為50r/min、200r/min、500r/min，或根據(jù)實際使用情況選擇一個或多個轉(zhuǎn)速測量點。用光電轉(zhuǎn)速表對準反光貼片位置測量實際轉(zhuǎn)速，每檔轉(zhuǎn)速下測量3次，取平均值x標準，通過式（7）計算轉(zhuǎn)速相對誤差。根據(jù)得到的不同轉(zhuǎn)速下的轉(zhuǎn)速誤差，選取其中絕對值最大的相對誤差值作為該生物發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速誤差。δL式中：δL——轉(zhuǎn)速相對誤差，r/min；xi——轉(zhuǎn)速設(shè)定值，r/min；x標準——轉(zhuǎn)速測量平均值，r/min。7.7液體流量設(shè)定值誤差和流量穩(wěn)定性根據(jù)儀器的計量需求，選擇需要計量的液體蠕動泵對象（一般為堿泵、酸泵、補料泵、消泡泵等相關(guān)泵管）。選擇適配的管路連接液體管路出口、入口，以純水作流動相，通過管路系統(tǒng)，使計量對象管路中充滿流動相。將溫度計插入流動相，監(jiān)控試驗溫度。選擇該蠕動泵的流速范圍中適當?shù)牧髁?，或根?jù)實際使用需求選擇一至三個流速測量點，分別進行測量。開啟蠕動泵，當泵運行穩(wěn)定后，選用事先稱重的合適的容量瓶，分別接收規(guī)定時間流出的流動相。不同流速下的測量次數(shù)、時間建議如下表。將收集好流動相的容量瓶在分析天平上稱重，重復三次，按公式（8）計算流量的實測值，分別按公式（9）和公式（10）計算流量設(shè)定值誤差SS及流量穩(wěn)定性誤差SR。表2泵流速測定參數(shù)表泵流速測定參數(shù)表（ml/min）0.2~1.01.0~1010~100測量次數(shù)333流動相收集時間（min）10~205~105Fm式中：Fm——流量實測值，mL/min；W1——容量瓶的質(zhì)量，g；W2——容量瓶加流動相的質(zhì)量，g；ρt——實驗溫度下流動相的密度（不同溫度下流動相的密度參見附錄B），g/cm3；t——收集流動相的時間，min。Ss式中：Ss——流量示值誤差，%；FmFs——流量設(shè)定值，mL/min。SR=式中：SR——流量穩(wěn)定性，%；Fmax——同一設(shè)定流量3次測量值的最大值，mL/min；Fmin——同一設(shè)定流量3次測量值的最小值，mL/min；Fm7.8氣體流量示值誤差選取實際常用的氣體介質(zhì)，將氣體流量測量裝置串聯(lián)入氣體流路中。調(diào)節(jié)反應器的氣體流量計，選擇用戶常用范圍內(nèi)一個或多個的氣體流量作為測量點，連續(xù)測量3次，記錄每次的測定值Qi，計算得平均值QδQ式中：QsQiδQ7.9無菌性能測試按操作要求以常規(guī)工作流程進行滅菌處理，選擇用戶常用的反應器準備流程和使用程序，進行培養(yǎng)反應24小時，或選擇用戶常用的培養(yǎng)時間，觀察培養(yǎng)液中是否有菌體生成。同時，通過無菌操作對最終培養(yǎng)液進行取樣，選擇合適的培養(yǎng)基（一般與反應器使用培養(yǎng)基一致），對原梯度的最終培養(yǎng)液進行平板稀釋涂布，平行處理3次。設(shè)定適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，將平板置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察是否有菌落形成。若儀器無菌性能良好，培養(yǎng)結(jié)束后，平板上應無菌落檢出（小于5CFU/mL）。8校準結(jié)果表達8.1校準記錄校準記錄格式參見附錄C。8.2校準結(jié)果的處理校準結(jié)果應在校準證書上反映，校準證書應至少包括以下信息：a）標題：“校準證書”；b）實驗室名稱和地址；c）進行校準的地點（如果與實驗室的地址不同）；d）證書的唯一性標識（如證書編號），每頁及總頁數(shù)的標識；e）客戶的名稱和地址；f）被校對象的描述和明確標識（如生產(chǎn)廠家、型號、產(chǎn)品編號等）；g）進行校準的日期，如果與校準結(jié)果的有效性和應用相關(guān)時，應說明被校對象的接收日期；h）如果與校準結(jié)果的有效性應用相關(guān)時，應對被校樣品的抽樣程序進行說明；i）校準所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標識，包括名稱和代號；j）本次校準所用測量標準的溯源性及有效性說明；k）校準環(huán)境的描述；l）校準結(jié)果及其測量不確定度的說明；m）對校準規(guī)范的偏離的說明；n）校準證書或校準報告簽發(fā)人的簽名、職務或等效標識；o）校準結(jié)果僅對被校對象有效的聲明；p）未經(jīng)實驗室書面批準，不得部分復制證書或報告的聲明。推薦的校準原始記錄格式、校準證書內(nèi)頁格式分別見附錄C、附錄D。9復校時間間隔由于復校時間間隔的長短是由儀器的使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等諸因素所決定的，因此送校單位可根據(jù)實際使用情況自主決定復校時間間隔。如果對儀器的檢測數(shù)據(jù)有懷疑或儀器更換主要部件及修理后應對儀器重新校準。生物反應器的復校時間間隔建議不超過12個月。

附錄A溶解氧校準用水的制備A.1無氧水的制備500mL的燒杯中加入250mL的蒸餾水，然后加入500mg的亞硫酸鈉以及微量二價鈷鹽（如六水合氯化鈷）作為催化劑。攪拌均勻后使用。A.2飽和溶氧水的制備在恒溫水浴內(nèi)灌入2/3容積的新鮮蒸餾水（約8L），將多孔塑料浮蓋浮于水面。水溫調(diào)節(jié)到所需溫度，開動攪拌器攪拌水樣，同時加鼓泡器（空氣泵）向水中連續(xù)曝氣60min以上。停止曝氣，水靜止30min后即可使用。

附錄B國際溫標純水密度表表B.11990年國際溫標純水密度表（kg/m3）t90（℃）0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.915999.099999.084999.069999.053999.038999.022999.006998.991998.975998.95916998.943998.926998.910998.893998.876998.860998.843998.826998.809998.79217998.774998.757998.739998.722998.704998.686998.668998.650998.632998.61318998.595998.576998.557998.539998.520998.501998.482998.463998.443998.42419998.404998.385998.365998.345998.325998.305998.285998.265998.244998.22420998.203998.182998.162998.141998.120998.099998.077998.056998.035998.01321997.991997.970997.948997.926997.904997.882997.859997.837997.815997.79222997.769997.747997.724997.701997.678997.655997.631997.608997.584997.56123997.537997.513997.490997.466997.442997.417997.393997.396997.344997.32024997.295997.270997.246997.221997.195997.170997.145997.120997.094997.06925997.043997.018996.992996.966996.940996.914996.888996.861996.835996.80926996.782996.755996.729996.702996.675996.648996.621996.594996.566996.53927996.511996.484996.456996.428996.401996.373996.344996.316996.288996.26028996.231996.203996.174996.146996.117996.088996.059996.030996.001995.97229995.943995.913995.884995.854995.825995.795995.765995.753995.705995.67530995.645995.615995.584995.554995.523995.493995.462995.431995.401995.37031995.339995.307995.276995.245995.214995.182995.151995.119995.087995.05532995.024994.992994.960994.927994.895994.863994.831994.798994.766994.73333994.700994.667994.635994.602994.569994.535994.502994.469994.436994.40234994.369994.335994.301994.267994.234994.200994.166994.132994.098994.06335994.029993.994993.960993.925993.891993.856993.821993.786993.751993.716

附錄C生物反應器校準原始記錄格式（推薦）送校單位：儀器名稱：規(guī)格型號：出廠編號：制造廠家：測量范圍：校準依據(jù)：校準地點：環(huán)境條件：溫度℃濕度％RH大氣壓kPa其它：使用的標準器名稱型號規(guī)格編號技術(shù)特征溫度示值誤差設(shè)定值/℃TR/℃EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R/℃TS/℃EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S/℃ΔT/℃溫度波動度溫度測量值/℃Tmax/℃Tmin/℃ΔTf/℃pH示值誤差及重復性液溫pH有證標準物質(zhì)/pH認定值/pHpH計測量值/pH平均值/pH示值誤差/pH重復性/pH℃校準點1CRM編號：批號：校準點2CRM編號：批號：校準點3CRM編號：批號：溶解氧濃度測量示值誤差及重復性標準值/（mg/L）測量值/（mg/L）平均值/（mg/L）示值誤差/（mg/L）重復性/（mg/L）轉(zhuǎn)速示值誤差設(shè)定轉(zhuǎn)速/（r/min）實際測量值/（r/min）平均值/（r/min）示值誤差/%液體流量設(shè)定值誤差和流量穩(wěn)定性FS/（mL/min）W1/gW2/gT/minFmFSSSR氣體流量示值誤差設(shè)定流量/（L/min）實際測量值/（L/min）平均值/（L/min）示值誤差/%無菌性能測試培養(yǎng)結(jié)束后平板上菌落計數(shù)為個。校準員：核驗員：校準日期：年月日

附錄D生物反應器校準證書內(nèi)頁格式（推薦）證書編號：××××-××××校準結(jié)果序號校準項目參考計量性能指標校準結(jié)果1溫度示值誤差±1.0℃2溫度波動度0.5℃3pH示值誤差±0.2pH4pH重復性0.1pH5轉(zhuǎn)速示值誤差±3%6溶解氧濃度示值誤差±0.5mg/L7溶解氧濃度重復性0.15mg/L8氣體流量示值誤差±5%9液體流量示值誤差±5%10液體流量穩(wěn)定性5%11無菌性能測試無菌落檢出溫度測量結(jié)果擴展不確定度：=%，=2；pH示值測量結(jié)果擴展不確定度：轉(zhuǎn)速測量結(jié)果擴展不確定度：溶解氧測量結(jié)果的擴展不確定度：氣體流量測量結(jié)果的擴展不確定度：液體流量測量結(jié)果的擴展不確定度：第×頁，共×頁

附錄E生物反應器校準結(jié)果的測量不確定度評定示例生物反應器的測量過程中主要涉及的參數(shù)有溫度、pH、溶解氧、攪拌轉(zhuǎn)速、氣體流量和液體流量，參數(shù)都為使用標準器進行直接測量，測量結(jié)果受其他環(huán)境因素的影響可忽略。因此，主要分析測量過程中對測量結(jié)果影響較大的不確定度分量來源，對其進行不確定度的評定。E.1溫度測量結(jié)果不確定度評定E.1.1測量方法按操作說明設(shè)置反應器恒溫溫度37℃，或根據(jù)實際使用情況設(shè)定一個或多個恒溫溫度點。將反應器的溫度探頭放入反應器內(nèi)，與標準數(shù)字溫度計靠近放置于反應器同一水平面。在設(shè)定的溫度點，同時分別讀取生物反應器溫度示值三次，取各自的三次平均值計算溫度示值相對誤差。E.1.2測量模型ΔT=EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R-EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S式中：EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R——生物反應器的溫度探頭平均值，℃；EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S——標準數(shù)字溫度計示值平均值，℃；ΔT——溫度示值誤差，℃。E.1.3不確定度來源依據(jù)上述測量模型，其不確定度來源主要包括以下2個方面：（1）反應器溫度探頭測量過程引入的不確定度uTi（2）標準數(shù)字溫度計測量過程引入的不確定度uTSE.1.4標準不確定度分量計算本示例中選取一臺生物反應器，設(shè)定溫度為37.0℃，等待儀器穩(wěn)定后，按確定測量方法重復測量溫度結(jié)果，連續(xù)測量10次，測量結(jié)果見表E.1。（1）反應器溫度探頭測量過程引入的不確定度uTi反應器溫度探頭測量過程引入的不確定度包括測量重復性引入的不確定度和儀器溫度示值分辨力引入的不確定度。表E.1溫度測量結(jié)果（單位：℃）測量次數(shù)12345678910儀器溫度示值37.037.036.936.936.936.937.037.137.137.0標準溫度計示值37.0136.9236.8936.9336.9136.8536.9337.0237.0837.02根據(jù)測試數(shù)據(jù)，則：sTi實際測量過程中取3次重復，反應器溫度探頭測量重復性引入的標準不確定度uTi1：uTi1儀器溫度示值分辨力為0.1℃，區(qū)間半寬為0.05℃，按均勻性分布考慮，則其分辨力引入的標準不確定度uTi2：uTi2因儀器溫度探頭測量重復性和示值分辨力引入的分量相關(guān)，故標準不確定度取較大者uTi1，因此，反應器溫度探頭測量過程引入的不確定度uTi為：uTi=uTi1=0.05℃（2）標準數(shù)字溫度計測量過程引入的不確定度uTS標準數(shù)字溫度計測量過程引入的不確定度包括測量重復性引入的不確定度、和儀器溫度示值分辨力引入的不確定度。根據(jù)重復測試數(shù)據(jù)結(jié)果，則：sTs實際測量過程中取3次重復，標準數(shù)字溫度計測量重復性引入的標準不確定度uTs1：uTs1數(shù)字溫度計示值分辨力為0.01℃，區(qū)間半寬為0.005℃，按均勻性分布考慮，則其分辨力引入的標準不確定度uTs2：uTs2因數(shù)字溫度計測量重復性和示值分辨力引入的分量相關(guān)，故標準不確定度取較大者uTs1。數(shù)字溫度計修正值的擴展不確定度為：U=0.03℃，k=2，則修正值引入的標準不確定度uTs3為：uTs3因此，數(shù)字溫度計測量過程引入的不確定度uTs為：uTsE.1.5標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量一覽表見表E.2。表E.2溫度測量結(jié)果標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量不確定度來源標準不確定度值（℃）uTi溫度探頭測量過程引入0.05uTs標準數(shù)字溫度計測量過程引入0.06E.1.6合成標準不確定度由于標準不確定度分量之間相互獨立，則溫度測量的合成標準不確定度uTc為：uTcE.1.7擴展不確定度取k=2，則儀器溫度示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為：UT=k×uTc=0.2℃E.2pH示值誤差測量結(jié)果不確定度評定E.2.1測量方法根據(jù)儀器操作方法對待測反應器的酸度（pH）計傳感探頭進行校準。根據(jù)實際需求選擇合適的pH標準溶液，使用儀器pH探頭對pH標準溶液進行測量。重復測量操作6次，取平均值作為儀器示值結(jié)果，其與pH標準溶液的標準值之差作為pH示值誤差。E.2.2測量模型ΔpH=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i-pHS式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i——儀器示值平均值，pH；pHS——pH溶液標準值，pH；ΔpH——pH示值誤差，pH。E.2.3不確定度來源依據(jù)上述測量模型，其不確定度來源主要包括以下2個方面：（1）pH傳感器測量過程引入的不確定度upHi（2）pH溶液標準物質(zhì)引入的不確定度upHSE.2.4標準不確定度分量計算本示例中選取一臺生物反應器，儀器穩(wěn)定后恒溫至25℃。將儀器pH傳感器校準后，對pH溶液標準物質(zhì)（本例使用混合磷酸鹽標準物質(zhì)）進行測量，按測量方法重復測量pH結(jié)果，連續(xù)測量10次，測量結(jié)果見表E.3。表E.3pH測量結(jié)果（單位：pH）測量次數(shù)12345678910儀器示值6.836.826.826.816.826.816.816.816.806.81（1）pH測量過程引入的不確定度upHi反應器pH探頭測量過程引入的不確定度包括測量重復性引入的不確定度和pH示值分辨力引入的不確定度。根據(jù)測試數(shù)據(jù)，則：spHi實際測量過程中取6次重復，反應器pH探頭測量重復性引入的標準不確定度upHi1：upHi1儀器pH示值分辨力為0.01pH，區(qū)間半寬為0.005pH，按均勻性分布考慮，則其分辨力引入的標準不確定度upHi2：upHi2因儀器pH探頭測量重復性和示值分辨力引入的分量相關(guān)，故標準不確定度取較大者，因此，反應器pH探頭測量過程引入的不確定度upHi為：upHi=upHi1=0.004pH（2）pH溶液標準物質(zhì)引入的不確定度upHSpH溶液標準物質(zhì)引入的不確定度包括標準物質(zhì)本身量值的不確定度和溫度對pH值影響的不確定度。根據(jù)標準物質(zhì)得知，pH溶液標準物質(zhì)的擴展不確定度為：U=0.01pH，k=2。則標準物質(zhì)本身量值引入的標準不確定度為：upHS在不同溫度下，pH標準物質(zhì)的pH是不同的。硼砂為原料的pH標準溶液溫度系數(shù)最大，其可能引入的不確定度也最高，因而以硼砂為例計算溫度對pH溶液標準物質(zhì)影響的不確定度。硼砂的pH值溫度系數(shù)為0.009/℃，則：upHS式中：δ1——恒溫水槽的均勻性，本例使用恒溫水槽均勻性為±0.2℃；δ2——恒溫水槽的穩(wěn)定性，本例使用恒溫水槽穩(wěn)定性為0.2℃；MPE——溫度探頭測溫的最大允許誤差，本例中測溫最大允許誤差為0.5℃。因此，pH溶液標準物質(zhì)引入的不確定度upHS為：upHSE.2.5標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量一覽表見表E.4。表E.4pH測量結(jié)果標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量不確定度來源標準不確定度值（pH）upHipH測量過程引入0.004upHSpH溶液標準物質(zhì)引入0.006E.2.6合成標準不確定度由于標準不確定度分量之間相互獨立，則pH測量的合成標準不確定度upH為：upE.2.7擴展不確定度取k=2，則儀器pH示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為：UpH=k×upH=0.02pHE.3溶解氧示值誤差測量結(jié)果不確定度評定E.3.1測量方法根據(jù)儀器操作方法對待測反應器的溶解氧傳感探頭進行測試、校準。根據(jù)實際需求配制好飽和溶解氧水，使用儀器溶解氧探頭對飽和溶氧水溶液進行測量。重復測量操作6次，取平均值作為儀器示值結(jié)果，其與飽和溶氧水的理論值之差作為溶解氧示值誤差。E.3.2測量模型ΔC=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)-CS式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)——6次溶解氧測量平均值，mg/L；；CS——溶解氧標準值，mg/L；ΔC——溶解氧示值誤差，mg/L。E.3.3不確定度來源依據(jù)上述測量模型，其不確定度來源主要包括以下2個方面：（1）溶解氧測量過程引入的不確定度uCi（2）飽和溶氧水溶液引入的不確定度uCSE.3.4標準不確定度分量計算本示例中選取一臺生物反應器，儀器運行至恒溫穩(wěn)定。使用儀器溶解氧探頭進行測量，按測量方法重復測量溶解氧結(jié)果，連續(xù)測量10次，測量結(jié)果見表E.5。表E.5溶解氧測量結(jié)果（單位：mg/L）測量次數(shù)12345678910儀器示值8.238.258.328.318.288.278.318.318.258.26（1）溶解氧測量過程引入的不確定度uCi反應器溶解氧探頭測量過程引入的不確定度包括測量重復性引入的不確定度和溶解氧示值分辨力引入的不確定度。根據(jù)測試數(shù)據(jù)，則：sCi實際測量過程中取6次重復，反應器pH探頭測量重復性引入的標準不確定度uCi1：uCi1儀器溶解氧示值分辨力為0.01mg/L，區(qū)間半寬為0.005mg/L，按均勻性分布考慮，則其分辨力引入的標準不確定度uCi2：uCi2因儀器溶解氧探頭測量重復性和示值分辨力引入的分量相關(guān)，故標準不確定度取較大者，因此，反應器溶解氧探頭測量過程引入的不確定度uCi為：uCi=uCi1=0.013mg/L（2）飽和溶氧水溶液引入的不確定度uCS在不同溫度和大氣壓力下，飽和溶氧水的溶解氧濃度是不同的。飽和溶氧水引入的不確定度來源主要包括飽和溶氧水發(fā)生裝置的溫度、大氣壓力。根據(jù)溶解氧飽和濃度值表和內(nèi)插法，本示例溫度為25.0℃，大氣壓為100.5kPa，那么該環(huán)境下溫度變化每升高1℃引起溶解氧變化的最大系數(shù)為0.15mg/L/℃，大氣壓力每升高0.1kPa引起的溶解氧變化的系數(shù)為0.085mg/L/kPa。本示例恒溫水槽的均勻性為±0.2℃，穩(wěn)定性為0.2℃，溫度測試最大允許誤差為0.5℃，空盒氣壓表的修正擴展不確定度為UP=0.05kPa，k=2。各引入的不確定度變量不相關(guān)，則，本示例中飽和溶氧水引入的不確定度uCS為：uCS式中：δ1——恒溫水槽的均勻性；δ2——恒溫水槽的穩(wěn)定性；MPE——溫度探頭測溫的最大允許誤差0.5℃；UP——氣壓修正不確定度。E.3.5標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量一覽表見表E.6。表E.6溶解氧測量結(jié)果標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量不確定度來源標準不確定度值（mg/L）uCi溶解氧測量過程引入0.013uCS飽和溶氧水溶液0.047E.3.6合成標準不確定度由于標準不確定度分量之間相互獨立，則溶解氧測量的合成標準不確定度uC為：uCE.3.7擴展不確定度取k=2，則儀器溶解氧示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為：UC=k×uC=0.10mg/LE.4轉(zhuǎn)速示值誤差測量結(jié)果不確定度評定E.4.1測量方法將反光轉(zhuǎn)速貼片貼于攪拌器旋轉(zhuǎn)葉片或轉(zhuǎn)動軸上，根據(jù)實際情況設(shè)置合適的轉(zhuǎn)速測量點。用光電轉(zhuǎn)速表對準反光貼片位置測量實際轉(zhuǎn)速，重復測量3次，取平均值x標準，并通過公式計算轉(zhuǎn)速相對誤差。E.4.2測量模型δ式中：δL——轉(zhuǎn)速相對誤差，r/min；xi——轉(zhuǎn)速設(shè)定值，r/min；x標準——轉(zhuǎn)速測量平均值，r/min。E.4.3不確定度來源依據(jù)上述測量模型，其不確定度來源主要包括以下3個方面：（1）轉(zhuǎn)速重復測量過程引入的相對不確定度ur1（2）標準器引入的相對不確定度ur2（3）攪拌電機分辨力引入的相對不確定度ur3E.4.4標準不確定度分量計算本示例中選取一臺生物反應器，儀器運行至攪拌電機運行轉(zhuǎn)速穩(wěn)定。使用光電轉(zhuǎn)速表對轉(zhuǎn)速進行測量，按測量方法重復測量轉(zhuǎn)速結(jié)果，連續(xù)測量10次，測量結(jié)果見表E.7。表E.7轉(zhuǎn)速測量結(jié)果（單位：r/min）測量次數(shù)12345678910實測值120.4120.2120.2120.3119.8119.7120.0120.1120.5120.2（1）轉(zhuǎn)速重復測量過程引入的相對不確定度ur1根據(jù)測試數(shù)據(jù)，則：sri實際測量過程中取3次重復，那么針對該轉(zhuǎn)速下：ur1（2）標準器引入的相對不確定度ur2根據(jù)光電轉(zhuǎn)速表的標準器溯源證書，可知其相對擴展不確定度為UrelS=0.01%，k=2。則標準器引入的相對不確定度ur2為：ur（3）攪拌電機分辨力引入的相對不確定度ur3儀器攪拌轉(zhuǎn)速示值分辨力為1r/min，區(qū)間半寬為0.5r/min，按均勻性分布考慮，則在該轉(zhuǎn)速下其分辨力引入的相對標準不確定度ur3：ur3E.4.5標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量一覽表見表E.8。表E.8轉(zhuǎn)速測量結(jié)果相對標準不確定度分量一覽表標準不確定度分量不確定度來源相對標準不確定度值（%）ur1轉(zhuǎn)速重復測量過程引入0.12ur2標準器引入0.005ur3攪拌電機分辨力0.24E.4.6合成相對標準不確定度由于相對標準不確定度分量之間相互獨立，則轉(zhuǎn)速測量的合成相對標準不確定度urx為：urxE.4.7相對擴展不確定度取k=2，則儀器轉(zhuǎn)速示值誤差測量結(jié)果的相對擴展不確定度為：Urx=k×urx=0.6%E.5液體流量示值誤差不確定度評定E.5.1測量方法根據(jù)生物反應器的配置需求，選擇相應的蠕動泵及管路。選擇適配的管路連接液體管路出口、入口，以純水作流動相，通過管路系統(tǒng)運行，使其充滿流動相。將溫度計插入流動相，監(jiān)控試驗溫度。根據(jù)需要選擇該蠕動泵的流速范圍中適當?shù)牧髁?，進行測量。開啟蠕動泵，運行穩(wěn)定后，選用事先稱重的合適的容量瓶，分別接收規(guī)定時間流出的流動相。將收集好流動相的容量瓶在分析天平上稱重，重復三次，分別計算流量的實測值和流量設(shè)定值誤差。E.5.2測量模型S式中：Ss——流量示值誤差，%；FmFs——流量設(shè)定值，mL/min。其中，流量實測值公式為：Fm=（W2-W1）/（ρt×t）式中：Fm——流量實測值，mL/min；W1——容量瓶的質(zhì)量，g；W2——容量瓶加流動相的質(zhì)量，g；ρt——實驗溫度下流動相的密度，g/cm3；t——收集流動相的時間，min。E.5.3不確定度來源依據(jù)上述測量模型，其不確定度來源主要包括以下3個方面：（1）液體流量重復測量引入的相對不確定度urF1（2）流動相引入的相對不確定度urF2（3）計時時間引入的相對不確定度urF3E.5.4標準不確定度分量計算本示例中選取生物反應器上的蠕動泵，設(shè)定流速為10ml/min，運行至穩(wěn)定。按測量方法重復測量流量結(jié)果，連續(xù)測量10次，測量結(jié)果見表E.9。表E.9液體流量測量結(jié)果（單位：