檢驗(yàn)科細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序SOP文件

檢驗(yàn)科細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-ResistantStaphylococci,MRS）MRS是引起臨床感染的常見(jiàn)病原菌，同時(shí)也是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，其耐藥特點(diǎn)是耐受甲氧西林的同時(shí)，還對(duì)臨床廣泛應(yīng)用的多種抗生素呈現(xiàn)多重耐藥，因而該菌所致感染已成為臨床治療的一大難題。（一）MRS測(cè)定方法1、紙片擴(kuò)散法接種物：直接懸液法從非選擇瓊脂平皿上挑取少許單個(gè)菌落至無(wú)菌生理鹽水調(diào)至濃度0.5McFarland,具體操作同常規(guī)紙片法藥敏試驗(yàn)。苯唑西林紙片，1Rg/片，檢測(cè)MRS平板應(yīng)置于35℃（而不是37℃）孵育24h（而不是16?18h）。結(jié)果判斷：金黃色葡萄球菌：S：三13mm；I：11?12mm；R:W10mm。凝固酶陰性葡萄球菌：S：三18mm；RW17mm。對(duì)于苯唑西林紙片周?chē)囊志?nèi)有任何小菌落或稀薄“菌膜”生長(zhǎng)都應(yīng)列為MRS。2、瓊脂篩選法：如果紙片試驗(yàn)結(jié)果中介時(shí)，可做瓊脂篩選法，培養(yǎng)基為MH瓊脂+6Rg/ml苯唑西林+4%NaCl,調(diào)整菌液濃度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生長(zhǎng)即使一個(gè)菌落均報(bào)MRS。（二）MRS監(jiān)測(cè)意義對(duì)于MRS,應(yīng)報(bào)告對(duì)所有頭抱菌素類(lèi)和其他B-內(nèi)酰胺酶類(lèi)耐藥，喹喏酮類(lèi)藥物，除氟哌酸外，環(huán)丙氟哌酸，氟嗪酸有較好抗菌活性（耐藥率10?23%之間），利福平敏感率在90%以上，未見(jiàn)耐萬(wàn)古霉素菌株，但已有萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌。二、高水平耐藥的腸球菌（HLAR）及耐萬(wàn)古霉素的腸球菌（VRE）（一）藥敏測(cè)定方法1、常規(guī)測(cè)定方法：采用K-B紙片擴(kuò)散法，頭抱菌素不用做（均為耐藥），氨芐，慶大霉素，替考拉寧，萬(wàn)古霉素一定要做。2、高水平氨基糖甙類(lèi)耐藥性測(cè)定：⑴高含量紙片擴(kuò)散法：通常測(cè)定慶大霉素和鏈霉素的高度耐藥性，具體操作如常規(guī)紙片法藥敏試驗(yàn)。藥敏紙片：慶大霉素：120rg/片；鏈霉素300pg/片結(jié)果判斷：R：W6mm；I：7~9mm；S：三10mm⑵含單一高濃度抗生素瓊脂平皿法：稀釋法：慶大霉素：R：三500Rg/ml；鏈霉素：R：2000pg/ml3、萬(wàn)古霉素耐藥性測(cè)定：紙片擴(kuò)散法，具體操作如常規(guī)紙片法藥敏試驗(yàn)，萬(wàn)古霉素紙片為：30pg/片，檢測(cè)平皿置35℃24h（而不是16?18h）,并注意抑菌圈內(nèi)有無(wú)小菌落或薄膜生長(zhǎng)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：S：三17mm；I：15?16mm；R：W14mm結(jié)果為中介時(shí)，應(yīng)補(bǔ)作MIC法。（二）高濃度藥敏測(cè)定意義腸球菌是引起臨床感染的常見(jiàn)病原菌之一，有天然抵抗多種抗生素的特性，臨床常用協(xié)同用藥治療腸球菌感染，但是當(dāng)腸球菌獲得了氨基糖甙類(lèi)活性酶后，會(huì)發(fā)展成高度對(duì)氨基糖甙類(lèi)耐藥性，而失去協(xié)同作用。通常腸球菌對(duì)氨基糖甙類(lèi)高水平耐藥測(cè)定可用慶大霉素或鏈霉素測(cè)定，如無(wú)高水平耐藥，預(yù)示可與青霉素氨芐西林協(xié)同用藥，若高度耐藥，預(yù)示協(xié)同用藥無(wú)效。耐萬(wàn)古霉素腸球菌，尚無(wú)規(guī)定的方案，可選氨芐西林聯(lián)合慶大霉素，聯(lián)合利福平等。三、耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)盡管目前國(guó)內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素的金葡菌（但已有中介的）但必須嚴(yán)密監(jiān)視其耐藥性，一旦發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)應(yīng)報(bào)告。（方法同常規(guī)法）

四、耐青霉素的肺炎鏈球菌（PRP）的監(jiān)測(cè)1、方法：用1pg/片苯唑西林紙片代替青霉素紙片測(cè)定PRP。2、判斷：抑菌環(huán)三20mm為敏感。抑菌環(huán)W19mm時(shí)要用稀釋法測(cè)定，不能報(bào)告。只有稀釋法確定后方可報(bào)告。3、注意點(diǎn)：用稀釋法測(cè)定PRP時(shí)應(yīng)選P、CTX、CRO、Va這些藥物來(lái)做。五、B-內(nèi)酰胺酶測(cè)定采用雙紙片協(xié)同法或頭抱硝基睡吩（Nitrocefin）紙片法，即用無(wú)菌蒸餾水將Nitrocefin紙片浸濕，挑取待檢菌涂抹在Nitrocefin紙片上，10min內(nèi)變紅者為陽(yáng)性?；虿捎肁S-4儀器檢測(cè)（需青霉素和碘試劑）。其意義主要是針對(duì)葡萄球菌，嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等，一般陰性桿菌不做此檢測(cè)。六、超廣譜B—內(nèi)酰胺酶（ESBLs）測(cè)定ESBLs是一類(lèi)水解底物相當(dāng)廣泛的B—內(nèi)酰胺酶，不僅能水解青霉素和一、二代頭抱菌素，還能水解三代頭抱菌素（如頭抱他啶，頭抱睡肟等）及單環(huán)B—內(nèi)酰胺類(lèi)，給臨床治療帶來(lái)相當(dāng)大的困難。ESBLs的基本概念是：①主要由克雷伯菌屬和大腸埃希菌等腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生，②在體外試驗(yàn)中，可使三代頭抱菌素和氨曲南的抑菌圈縮小，但并不一定在耐藥范圍，③加入克拉維酸可使其抑菌環(huán)擴(kuò)大，④臨床上對(duì)B—內(nèi)酰胺類(lèi)藥物（包括青霉素和頭抱菌素）耐藥，但對(duì)碳青霉烯類(lèi)和頭霉烯類(lèi)藥物敏感，⑤由質(zhì)粒介導(dǎo)往往由普通的B—內(nèi)酰胺酶基因（TEM-1,TEM-2,SHV-1）突變而來(lái)。（一）ESBLs測(cè)定.紙片擴(kuò)散初篩法：按美國(guó)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施。具體操作如常規(guī)紙片法藥敏試驗(yàn)，符合如下標(biāo)準(zhǔn)之一為產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌。頭抱泊肟 10pg/片W22mm頭抱他啶 30pg/片W22mm氨曲南30氨曲南30pg/片W27mm頭抱睡肟 30pg/片W27mm頭抱曲松 30pg/片W25mm.雙紙片增效擴(kuò)散法：用頭抱他啶（30|Jg）頭抱他啶/棒酸（30|Jg/10pg）頭抱睡肟（30rg）頭抱睡肟/棒酸（30mg/10|jg）紙片按擴(kuò)散法進(jìn)行，以任一抗生素復(fù)合物與單獨(dú)藥的抑菌圈直徑之差三5mm為產(chǎn)ESBLs菌。.雙紙片協(xié)同擴(kuò)散法：藥敏平板與菌液的制備方法與常規(guī)藥敏相同，先在平板中心貼上阿莫西林/棒酸紙片，而后在其上下左右貼30pg/片的頭抱他啶，頭抱睡肟，頭抱曲松和氨曲南紙片，各紙片相距20?30mm（中心一中心），35℃18?24h觀察結(jié)果如周?chē)?個(gè)藥敏紙片中的任何一個(gè)顯示協(xié)同即為產(chǎn)ESBLs菌。（二）ESBLs測(cè)定意義臨床分離的大腸埃希菌和克雷伯菌（主要是肺克和產(chǎn)酸兩種），均應(yīng)檢測(cè)是否產(chǎn)生ESBLs,如確認(rèn)為ESBLs菌株，不管體外藥敏試驗(yàn)的結(jié)果如何，對(duì)所有三代頭抱菌素和氨曲南均應(yīng)報(bào)告耐藥。針對(duì)ESBLs的特性和耐藥特點(diǎn)，臨床治療推薦使用：①碳青霉烯類(lèi)：泰能等。②復(fù)合三代頭抱菌素：舒普深等加大劑量。還有頭霉素類(lèi)，環(huán)丙沙星，氨基糖甙類(lèi)聯(lián)合使用。七、AmpCB-內(nèi)酰胺酶（持續(xù)型）測(cè)定AmpCB-內(nèi)酰胺酶是頭抱菌素酶，為Bush分類(lèi)C組I型酶，通常稱(chēng)為I型AmpC酶。產(chǎn)該酶菌株對(duì)［3-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌素廣泛耐藥（含窄譜、廣譜、超廣譜和含酶抑制劑的抗菌素及氨曲南）。（一）、單紙片擴(kuò)散法（初篩試驗(yàn)）將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，在平板上貼上CAZ、CTX、CRO、AZT、CPI（頭抱泊月虧）、CFT（頭抱西?。?，置35℃過(guò)夜培養(yǎng)，若抑菌環(huán)直徑CAZW14mm、CTXW14mm、CROW13mm、AZTW15mm、CPIW14mm、CFTW14mm時(shí)為可疑產(chǎn)AmpC酶菌株?；虿捎茫篒P（亞胺培南）、FEP（頭抱吡月虧）、CD02（他啶+棒酸）、CTX、FOX（頭抱西?。┘埰N于待測(cè)菌平板上，35℃過(guò)夜培養(yǎng)。AmpC酶可疑菌株應(yīng)為：FEP、IP為敏感，而CTX、CD02、CD03均耐藥或者在CD02、CD03和CTX的抑菌環(huán)內(nèi)存在散在菌落?；蛘呤荌P為敏感，F(xiàn)EP、CTX、CD02、CD03均為耐藥。（二）雙紙片協(xié)同法（初篩試驗(yàn)）將含有200pg/片氯唑西林紙片（FCC）貼于MH平板中央，周?chē)謩e貼上CAZ、CTX、CRO、AZT、CPI、CFP（頭抱哌酮）紙片，紙片中心距離為20mm,置35℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察有無(wú)協(xié)同現(xiàn)象，F(xiàn)CC與任何一種ESC有協(xié)同現(xiàn)象者為AmpC酶陽(yáng)性菌株。（三）雙紙片增效法：即加有氯唑西林的復(fù)合紙片減去單藥紙片的差Nmm時(shí)為陽(yáng)性。六組紙片中，只要有一組三5mm即可，六組紙片參見(jiàn)（二