《規(guī)?；雠２《拘愿篂a病毒（BVDV）基 因分型與防制》

ICS01.040.65

CCSB04TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIA×××-××××

規(guī)?；雠２《拘愿篂a病毒（BVDV）基

因分型與防制

Technicalregulationsforgenotypingandpreventionofbovineviral

diarrheavirus(bvdv)inlarge-scalecattlefarms

(征求意見稿)

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實施

寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會發(fā)布

發(fā)布

規(guī)?；雠２《拘愿篂a病毒（BVDV）基因分型與防制

1范圍

本文件規(guī)定了規(guī)模化牛場牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)RT-PCR基因分型與防制的術(shù)語和定義、

診斷、預(yù)防和凈化。

本文件適用于規(guī)?；鰧δ膛！⑷馀?、黃牛、牦牛、犏牛等牛科動物的牛病毒性腹瀉病毒

（BVDV）RT-PCR基因分型與防制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489-2008實驗室生物安全通用要求

GB/T27401-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫

農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]25號病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1牛病毒性腹瀉病BovineViralDiarrheaVirus

牛病毒性腹瀉/黏膜病簡稱為牛病毒性腹瀉病，是指由牛病毒性腹瀉病毒引發(fā)牛的一種傳染病，

臨床上以發(fā)熱、腹瀉、呼吸道癥狀、出血綜合征、黏膜糜爛、白細(xì)胞減少、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)畸型

胎為主要特征。

3.2RT-PCR基因分型RT-PCRgenotyping

即利用分子生物學(xué)方法，對其基因進(jìn)行分型的技術(shù)。

4流行病學(xué)

各種年齡的牛都易感染、以幼齡牛易感性最高。傳染來源主要是病畜。病牛的分泌物、排泄物、

血液和脾臟等都含有病毒，以直接接觸或間接接觸方式傳播。牛病毒性腹瀉病毒可以穿過胎盤感染，

特別是懷孕早期。牛病毒性腹瀉—黏膜病毒血清抗體陰性的母牛一旦感染，常常通過胎盤使胎兒產(chǎn)

生免疫抑制，引起持續(xù)性病毒血癥，如果小牛正常產(chǎn)出，病毒血癥能持續(xù)地帶入成年期，這種牛體

內(nèi)始終帶毒，是牛群中最危險的傳染源。

2

5RT-PCR基因分型

5.1樣品采集

用無菌注射器直接采集血液或者抗凝血至滅菌離心管，或使用獸用采血針、真空無菌采血管、

真空無菌抗凝管采血管，采集全血或抗凝全血，編號備用。

5.2樣品處理

5.2.1血清處理

使用無抗凝劑采血器，采血后采血管傾斜于25℃～37℃靜置30min～45min，待血液完全凝固，

轉(zhuǎn)速8000rpm離心10min或4000rpm離心30min，用移液槍把血清移入儲存管備用。

5.2.2全血的處理

5.2.2.1采血

使用抗凝枸櫞酸葡萄糖（ACD）為抗凝劑。利用滅菌離心管收集血液時，加入1/6體積的ACD

抗凝劑，充分混勻；利用商品化EDTA抗凝采血管收集血液時，直接收集血液并混勻即可。

5.2.2.2RNA的提取

在樣本制備區(qū)，根據(jù)待檢樣品數(shù)量取n個無RNAse離心管，編號。每管中加入600μLTrizol，分

別加入100μL待檢血清或抗凝血，充分混勻后加入200μL氯仿，充分顛倒混勻；于4℃、12000g離

心15min，小心吸取上清至一新的無RNAse離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，4℃、12000g

離心10min；棄上清，加入1mLDEPC水配制的冰冷75%乙醇充分洗滌沉淀；4℃、12000g離心5

min，棄上清，12000g離心10s，吸去殘存的液體，室溫風(fēng)干3min，加入適量（20～25μL）DEPC

水溶解，直接用于檢測或-80℃保存。

5.3基因分型

5.3.1套式RT-PCR

參考文獻(xiàn)（DecaroN,etal.,2012.AnestedPCRapproachforunambiguoustypingofpestiviruses

infectingcattle；GaoS,etal.,2016.Genomeanalysisofanatypicalbovinepestivirusfromfetalbovine

serum）中的引物，分別為:

PanBVDVpcrF（5′-CTCTGCTGTACATGGCACATG-3′）

PanBVDVpcrR（5′-TTCTCACTNGCRTCCATCAT-3′）

BVDV-1npcrF（5′-TTTCAAGCTGCTCHGAYAC-3′）

BVDV-2npcrF（5′-ATCCTGACCAATGCTAGGTCC-3′）

BVDV-3npcrF（5′-TCCTGTGGCAACCGGTAGGT-3′）

取2μL待檢RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，每個反應(yīng)體系需要25μL反應(yīng)液，含2XStepBuffer12.5μL、

上游引物PanBVDVpcrF（10μM）1μL、下游引物PanBVDVpcrR（10μM）1μL、1XStepEnzymeMix

1μL、DEPC水7.5μL。根據(jù)檢測的RNA數(shù)量（n），首先配制n+1個體系的反應(yīng)液，混勻后分裝至N+1

個PCR管中，分別加入1μL待檢RNA、DEPC水對照，混勻瞬時離心后進(jìn)行第一輪RT-PCR擴(kuò)增。反

應(yīng)參數(shù)為：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃10min。

反應(yīng)結(jié)束后取1μLPCR產(chǎn)物稀釋至49μLDEPC水中。取2μL第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行BVDV-1、

BVDV-2、BVDV-3的分型檢測。反應(yīng)體系為PremixTaq（dyeplus）12.5μL、引物BVDV-1

npcrF/PanBVDVpcrR(10μM）各1μL或引物BVDV-2npcrF/PanBVDVpcrR(10μM）各1μL，或引物

BVDV-3npcrF/PanBVDVpcrR(10μM）各1μL，DEPC水10.5μL，待檢第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2.0μL。反應(yīng)

程序為98°C10s，55°C30s，72°C1min,30個循環(huán)，72℃10min。利用含GelRed核酸染料的1%瓊脂

糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。目的條帶的大小分別為：BVDV-1，505bp；

BVDV-2，833bp；BVDV-3，211bp。

5.3.2熒光定量RT-PCR

參考文獻(xiàn)（Baxietal.,2006.Aone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRfordetectionandtypingof

bovineviraldiarrheaviruses;Liuetal.,2008.ATaqManreal-timeRT-PCRassayforselectivedetection

ofatypicalbovinepestivirusesinclinicalsamplesandbiologicalproducts.）中的引物，在一反應(yīng)管中同

時檢測BVDV-1和BVDV-2，在另一反應(yīng)管中對BVDV-3單獨進(jìn)行檢測。

5.3.2.1BVDV-1和BVDV-2分型

檢測BVDV-1和BVDV-2的引物為PestiF：5'-CTAGCCATGCCCTTAGTAG-3'，PestiR：5'-

CGTCGAACCAGTGACGACT-3'，探針為

BVDV-1P：FAM-TAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT-BHQ

BVDV-2P：TxR-TAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC-BHQ

反應(yīng)體系為25μL，以MX3000Preal-timePCR儀器檢測為例，每一體系中加入2XOneStep

RT-PCRBuffer12.5μL、ExTaq0.50μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.50μL、PestiF（10μM）0.50μL、PestiR（10

μM）0.50μL、BVDV-1P（10μM）0.25μL、BVDV-2P（10μM）0.25μL、ROXReferenceDyeorDyeⅡ

0.50μL、DEPC水8.25μL，待檢RNA1.0μL，反應(yīng)程序為42℃5min；95℃10s進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然

后按95℃5s、60℃30s在熒光定量RT-PCR進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增。在擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定

樣品中BVDVRNA的存在與否以及BVDV基因型（FAM通道的擴(kuò)增曲線表示BVDV-1陽性，TxR

（ROX）通道擴(kuò)增曲線表示BVDV-2陽性）。

5.3.2.2BVDV-3分型

檢測BVDV-3的引物為

T34F：5'-GACTAGTGGCAGTGAGC-3'

T220R：5'-GAGGCATTCCTTGATGCGTC-3'

4

BVDV-3PFAM-ACTCGGGGCTTCGGTGATCCAGGG-BHQ

反應(yīng)體系為25μL，以MX3000Preal-timePCR儀器檢測為例，每一體系中加入2XOneStep

RT-PCRBuffer12.5μL、ExTaq0.50μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.50μL、T34F（10μM）0.50μL、T220R（10

μM）0.50μL、BVDV-3P（10μM）0.25μL、ROXReferenceDyeorDyeⅡ0.50μL、DEPC水8.50

μL，待檢RNA1.0μL，反應(yīng)程序42℃，5min；95℃，10s進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后按95℃5s、60℃30

s在熒光定量RT-PCR進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增。在擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定樣品中BVDV-3RNA存

在與否（FAM通道擴(kuò)增曲線表示BVDV-3陽性）。

5.4BVD防制規(guī)程

見附件B

附錄A

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

以下所用試劑均為分析純

A.1抗凝枸櫞酸葡萄糖（ACD）為抗凝劑

稱取檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g溶于100mL去離子水中，高壓滅菌。

A.2DEPC水

在通風(fēng)櫥中,將DEPC加入去離子水（符合GB/T6682）中至終濃度為0.1%，充分作用12h。

121℃高壓滅菌30min，冷卻后分裝備用。

A.350×TAE貯存液

Tris堿242.0g

冰醋酸57.1mL

EDTA（0.5mol/L，pH8.0）100.0mL

加蒸餾水定容至1000mL，在1.034×105Pa壓強(qiáng)下蒸汽滅菌20min，使用時用蒸餾水稀釋成

1×TAE。

A.41.0%瓊脂糖凝膠

瓊脂糖1g

加1×TAE定容至100mL，在微波爐中加熱融化、混勻，冷卻至55℃，加入適合濃度的核酸染

料，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，凝固后移去樣品梳，當(dāng)天使用。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

BVD防制規(guī)程

牛病毒性腹瀉病，是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬。

該病毒是有囊膜的正鏈RNA病毒，能通過胎盤感染在妊娠期30d至150d的懷孕母牛，引起流產(chǎn)、

死產(chǎn)或者犢牛未成年死亡，造成大量經(jīng)濟(jì)損失。幸存下來的犢牛對該病毒產(chǎn)生“免疫耐受”現(xiàn)象，并

轉(zhuǎn)化為持續(xù)感染（PI）牛。PI牛是BVDV傳播的重要傳染源。PI牛每天排出大量病毒，并傳染群

體中其它動物。這些帶毒牛通常在2歲之內(nèi)死于黏膜病，部分牛只可存活2年甚至更長。各生產(chǎn)階

6

段的奶牛（犢牛、后備牛、產(chǎn)奶牛）和公牛都可被暫時感染，感染持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，直至其免疫系

統(tǒng)清除病毒。雖然BVDV感染造成的死亡率低，但該病毒會降低牛只自身免疫力，從而導(dǎo)致牛只對

其它疾病更易感，如乳房炎、口蹄疫、牛傳染性鼻氣管炎（IBR）、腹瀉、肢蹄病等。BVDV有兩

種感染方式，一種是急性感染（TI），BVDV可以感染各年齡段的牛，影響奶牛場生產(chǎn)的各個方面：

從奶的質(zhì)量和產(chǎn)量，到犢牛健康和獸醫(yī)費用。另一種是持續(xù)感染（PI），從繁殖性能到動物使用年

限。急性感染是由于牛只接觸了PI牛或者其它急性感染牛，一般持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，感染期間，感染

會抑制牛只的免疫系統(tǒng)（免疫抑制），導(dǎo)致牛只對繼發(fā)感染敏感，例如乳房炎和體細(xì)胞數(shù)的增加。

持續(xù)感染僅發(fā)生在，當(dāng)BVDV感染懷孕母牛時，該母牛正處于其妊娠期的第30-150d接觸該病毒，

病毒進(jìn)入胚胎而產(chǎn)生。PI牛經(jīng)常無臨床表現(xiàn)，但終身感染，排毒量是急性感染的1000倍。PI犢牛

存活下來，不僅成活率低，而且在存活期間會持續(xù)傳播病毒。PI牛帶來的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越單一的牛舍

或者牧場。病毒可以傳播到相鄰的牛舍或牧場，因此會存在大量的動物迅速被感染和再感染的潛在

危險。

B1.牛病毒性腹瀉最大的危害是持續(xù)感染

B1.1繁殖影響，包括空懷率高、流產(chǎn)、木乃伊胎、早期胚胎死亡、死胎或弱犢。

B1.2腹瀉，尤其在初次感染時，多見于青年牛。

B1.3產(chǎn)奶量降低，乳質(zhì)降低。

B1.4生長緩慢，先天缺陷，發(fā)育不良。

B1.5免疫抑制長達(dá)6周，使牛只易感染其它疾病，如乳房炎、肺炎和牛呼吸道綜合征（BRD）、

肺溶血性巴氏桿菌感染等。

B1.6感染胎兒，生出PI犢牛，PI母牛經(jīng)常會發(fā)生早期胚胎損失，或者產(chǎn)出死胎或木乃伊胎兒。即

使能順利生出的犢牛，所產(chǎn)犢牛100%為PI犢牛。這些犢牛成活率低，生長狀況不好，而且持續(xù)大

量排毒、并易感其它疾病，影響整個群體的健康和生產(chǎn)狀況。

B2制定牛病毒性腹瀉最佳控制方案和凈化策略

B2.1只引入非PI牛。購入的妊娠母牛所產(chǎn)的犢牛，只有進(jìn)行BVDV抗原檢測，確認(rèn)為陰性，方可

進(jìn)入現(xiàn)有牛群并允許配種。

B2.2配種前，對所有未接受過BVDV抗原檢測的犢牛和后備牛以及群中無后代的母牛（如流產(chǎn)、

沒有確認(rèn)懷孕、所生犢牛死亡或淘汰、所生犢牛為公犢出售等）進(jìn)行BVDV抗原檢測。

B2.3持續(xù)對全部新生犢牛進(jìn)行BVDV抗原檢測。

B2.4認(rèn)真記錄并保存檢測結(jié)果。

B2.5設(shè)計免疫方案，選擇適合的疫苗和免疫時間。需要考慮公牛、斷奶前、斷奶、青年牛和引入非

PI牛。購入的妊娠母牛所產(chǎn)的犢牛，只有進(jìn)行BVDV抗原檢測，確認(rèn)為陰性，方可進(jìn)入現(xiàn)有牛群

并允許配種。

B26與獸醫(yī)、相鄰牧場和后備牛供應(yīng)商合作，及時發(fā)現(xiàn)風(fēng)險，將BVDV進(jìn)入牛群的風(fēng)險降到最低。

B2.7免疫是控制BVD的工具之一，目前已有商品化疫苗用于預(yù)防牛病毒性腹瀉/黏膜病。3月齡以上

健康牛肌肉注射，每頭接種2.0mL，21日后以相同劑量進(jìn)行二免，免疫期為6個月。但是如果PI牛存

在于群體中，單純只依靠免疫不能將牧場風(fēng)險降到最低，推薦采取免疫接種與PI牛檢測淘汰的綜合

防控措施。

B3如何處理抗原陽性的檢測結(jié)果

B3.1確定群體目標(biāo)和相應(yīng)的措施。

B3.2如果犢牛被懷疑是PI牛，應(yīng)盡早實施隔離并采集血液進(jìn)行BVDV抗原檢測（利用套式RT-PCR

或熒光定量進(jìn)行病毒分型），檢測陽性者應(yīng)保持隔離，間隔15d進(jìn)行第二次采樣檢測。如果犢牛確

認(rèn)是PI牛，應(yīng)對其無害化處理，以切斷BVDV向繁育群體的傳播。

B3.3對PI牛的母親進(jìn)行BVDV抗原檢測（PI牛的母親也可能是PI牛）。

B3.4如果確認(rèn)PI牛的母親不是PI牛，那么其母親不需要被淘汰。

B3.5與獸醫(yī)、相鄰牧場和后備牛供應(yīng)商合作，及時發(fā)現(xiàn)風(fēng)險，將BVDV進(jìn)入牛群的風(fēng)險降到最低。

B4.對于牛病毒性腹瀉的幾種誤解

B4.1弱毒疫苗可以消除PI犢牛事實：試驗表明，注射弱毒疫苗后，并不能引起PI犢牛發(fā)病或死亡。

然而，也有報道表明，弱毒疫苗可以導(dǎo)致PI犢牛生病或死亡，但不是100%發(fā)生。

B4.2PI牛很瘦，皮毛不好，而且是一個生產(chǎn)性能表現(xiàn)不好的牛事實：盡管大多數(shù)PI牛不健康，但報

告指出，50%以上的持續(xù)感染牛表現(xiàn)正常，并以很好的狀態(tài)進(jìn)入泌乳牛群。PI牛不能用肉眼判斷。

只能通過檢測來較弱病毒發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)。

B4.3犢牛是PI牛，因為他們的母親是PI牛事實：最近研究表明，7%PI牛的母親是PI牛；但另外93%

的PI牛的母親是免疫機(jī)制正常的非PI牛。

B4.4PI牛引起的最重要的經(jīng)濟(jì)損失是該牛只的死亡事實：低受孕率、頻繁流產(chǎn)和犢牛死亡率高等相

關(guān)聯(lián)的繁殖損失是持續(xù)感染動物所造成的最大經(jīng)濟(jì)損失。

B4.5BVDV不會感染已免疫的牛只事實：PI牛所散發(fā)的大量病毒能夠攻克在攻擊下起保護(hù)作用的一

定層次的免疫保護(hù)，單純免疫不能解決BVDV問題。

B5檢測的價值

B5.1PI牛檢測帶來200元/頭牛的價值。不再浪費時間治療大量病牛。

B5.2PI陰性狀態(tài)說明動物不是持續(xù)感染BVDV，能夠極大降低產(chǎn)業(yè)鏈傳播疾病的風(fēng)險。

B5.3BVD給產(chǎn)業(yè)造成損失在美國超過10億元。檢測會挽回?fù)p失。

B6牛病毒性腹瀉的檢測工具

B6.1ELISA實驗室檢測--BVDV抗原/抗體檢測試劑盒，可以掌握流行病學(xué)。