遺傳病的診斷課件

第16章遺傳病的診斷Contents

癥狀和體征分析系譜分析染色體檢查生化檢測(cè)基因診斷方法癥狀和體征分析

癥狀和(或)體征的出現(xiàn)是患者就診的主要原因，也是診斷遺傳病的重要線索。表型—基因—疾病之間的關(guān)系不是一一對(duì)應(yīng)的。

癥狀與體征僅僅是進(jìn)行遺傳病診斷的線索，遺傳病的確診必須借助于其他檢查手段。

系譜分析（PedigreeAnalysis）①資料必須可靠；②涉及家庭成員的隱私問(wèn)題，如是否是近親婚配，同胞之間是否為同父同母等，說(shuō)服被調(diào)查者積極配合；③注意外顯不全、延遲顯性、新突變基因、動(dòng)態(tài)突變、……等問(wèn)題；④應(yīng)盡可能地?cái)U(kuò)大家系范圍，以便更準(zhǔn)確地判斷；⑤有些疾病（如色盲、耳聾等）可能存在“同病通婚”的情況

染色體檢查染色體檢查或稱核型分析是確診染色體病的主要方法，在某些情況下，也用于對(duì)單基因病的診斷。染色體檢查——指征智能發(fā)育不全、生長(zhǎng)遲緩或伴有其它先天畸形者；夫婦中有染色體異常，如平衡易位、嵌合體等；家族中已發(fā)現(xiàn)染色體異?；蛳忍旎蝹€(gè)體；多發(fā)性流產(chǎn)的婦女及其丈夫；原發(fā)閉經(jīng)和男女不育不孕者；34歲以上的高齡孕婦；有內(nèi)外生殖器畸形者。FISH結(jié)果

生化分析生化分析主要是對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物，如酶或其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能活性進(jìn)行檢測(cè)；生化檢查常通過(guò)對(duì)反應(yīng)底物、中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物或受體、配體的測(cè)定；該方法特別適用于分子病、先天性代謝缺陷、免疫缺陷類的遺傳病診斷；基因診斷（Genediagnosis）基因診斷（Genediagnosis）是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)體內(nèi)DNA或RNA在結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平上的變化，從而對(duì)疾病做出診斷的方法，通常又稱為分子診斷（moleculardiagnosis）。

DNA水平的診斷直接診斷：直接檢出DNA分子上的致病突變，這是進(jìn)行基因診斷最可靠的辦法。

間接診斷：連鎖分析

基因產(chǎn)物水平的診斷mRNA檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)基因診斷的技術(shù)核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸分子雜交DNA變性：DNA分子由雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湹默F(xiàn)象DNA復(fù)性：變性的兩條單鏈恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,可發(fā)生在同源雙鏈間，也可發(fā)生在非同源兩條鏈間核酸分子雜交：應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA(或RNA)片段，嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在一定條件下形成雜交雙鏈分子聚合酶鏈反應(yīng)PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。PCR步驟①模板DNA的變性：②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：③引物的延伸：特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速、對(duì)標(biāo)本的純度要求低熒光定量PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′－3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步；實(shí)時(shí)熒光定量PCR中SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。DNA芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交。通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，得出樣品的遺傳信息。

DNA芯片DNA芯片技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)：①基因診斷的速度顯著加快；②檢測(cè)效率高，每次可同時(shí)檢測(cè)成百上千個(gè)基因序列，使檢測(cè)過(guò)程平行化。③基因診斷的成本降低；④自動(dòng)化程度顯著提高；⑤因?yàn)槭侨忾]，避免了交叉污染；熒光免疫雜交對(duì)于染色體及亞染色體水平尺度上遺傳物質(zhì)的改變利用了核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)的特性進(jìn)行熒光素標(biāo)記,然后將探針與染色體或DNA纖維切片雜交，在熒光顯微鏡下可直接觀測(cè)并進(jìn)行定位和定性或相對(duì)定量分析FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長(zhǎng)期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不但能顯示中期分裂相，還能顯示于間期核。比較基因組雜交多重探針連接擴(kuò)增(MLPA)SSCP/DHPLC/HRMDNA測(cè)序序列測(cè)定是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)，是基因突變檢測(cè)的最直接、最準(zhǔn)確的方法。第一代、第二代、第三代測(cè)序技術(shù)甲基化檢測(cè)甲基化檢測(cè)的原理是基于DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，所有未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏o(wú)此改變。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和NorthernBlotting

RNA診斷分析基因的表達(dá)和功能，即檢測(cè)基因能否轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄物（mRNA）是否正常以及轉(zhuǎn)錄效率的高低等。RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（ReverseTranscription）和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合分析基因表達(dá)的的技術(shù)。

Northern印跡雜交（Northernblot）是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。被測(cè)樣品是RNA。基因診斷的實(shí)例杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）鐮狀細(xì)胞貧血β654地中海貧血血友病A多重PCR診斷DMD基因缺失Sorthern雜交診斷鐮狀細(xì)胞貧血RT-PCR診斷β地貧（β

–IVSII-654）PCR-RFLP診斷診斷血友病A患者遺傳病診斷的時(shí)機(jī)癥狀前診斷產(chǎn)前診斷著床前診斷產(chǎn)前診斷①遺傳學(xué)檢查細(xì)胞培養(yǎng)、染色體檢查、分子診斷等；②生化檢查特殊蛋白質(zhì)、酶、代謝底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物等；③物理診斷B超、X線、胎兒鏡、電子監(jiān)護(hù)等。羊膜穿刺法絨毛取樣法臍帶穿刺妊娠18周左右臍帶穿刺法是在B超的監(jiān)視下，用細(xì)針經(jīng)腹壁、子宮進(jìn)