第四章 抗體制藥 (2)課件

第四章

抗體制藥第四章抗體制藥(2)第一節(jié)概述

1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開(kāi)創(chuàng)了抗體制藥之先河。1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。γ球蛋白制劑是緊急預(yù)防甲型肝炎等傳染病的有效藥物。第四章抗體制藥(2)

抗體（Antibody）是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化、增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。第四章抗體制藥(2)免疫球蛋白與抗體的關(guān)系20世紀(jì)60年代初期，發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類(lèi)似的球蛋白，統(tǒng)稱(chēng)為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念。所有的抗體均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗體活性。第四章抗體制藥(2)多克隆抗體與單克隆抗體多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此產(chǎn)生的抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱(chēng)多克隆抗體。病原診斷時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性。第四章抗體制藥(2)1975年Kǒhler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibody，McAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來(lái)源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。第四章抗體制藥(2)單克隆抗體定義是將抗體產(chǎn)生的細(xì)胞與具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的抗體。第四章抗體制藥(2)單克隆抗體的應(yīng)用

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用于疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。第四章抗體制藥(2)

單克隆抗體用于臨床治療，如針對(duì)于T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3（Clusterofdifferentiation,CD3）的單克隆抗體作為因?qū)ζ鞴僖浦裁庖吲懦庥幸种谱饔?，用作免疫抑制劑已?jīng)上市。以單克隆抗體作為藥物的載體對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治療。第四章抗體制藥(2)從1984年報(bào)道人—鼠嵌合抗體以來(lái)，已制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等諸多類(lèi)型，基本上消除了鼠源性單克隆抗體的免疫原性，相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1／80—1／3，原來(lái)鼠源性單克隆抗體的諸多生物學(xué)活性已消失，如激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬功能(免疫調(diào)理)、抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒副作用等，只保留同抗原特異性結(jié)合的活性，即僅應(yīng)用其導(dǎo)向作用，制備導(dǎo)向藥物用于腫瘤治療。第四章抗體制藥(2)第二節(jié)單克隆抗體

是將抗體產(chǎn)生的細(xì)胞與具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的；它的結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。第四章抗體制藥(2)一、抗原與動(dòng)物免疫

制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。

第四章抗體制藥(2)有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛。但在多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化，如部分純化的干擾素。在經(jīng)過(guò)克隆化選出最適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w。在制備惡性腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體時(shí)，情況更為復(fù)雜，需要整個(gè)腫瘤細(xì)胞作為免疫原，經(jīng)過(guò)篩選、克隆化制備出僅存于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上的表面標(biāo)志分子的單克隆抗體。第四章抗體制藥(2)

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫的動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體是同一品系動(dòng)物。常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。第四章抗體制藥(2)

免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10７個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。第四章抗體制藥(2)可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般在采集脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，目的是最大限度刺激B細(xì)胞分裂為漿細(xì)胞，合成大量的抗體。第四章抗體制藥(2)有人主張采用脾內(nèi)免疫法。

脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接把

0.1～0.2mL抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10μg，節(jié)省抗原量。

第四章抗體制藥(2)

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。

優(yōu)點(diǎn)：需抗原量少（幾個(gè)μg），免疫期短（４～５d），干擾因素少。第四章抗體制藥(2)體外免疫法基本方法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單個(gè)細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/mL,在5%CO2、37℃下培養(yǎng)4～5d,再分離脾細(xì)胞,與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交。o第四章抗體制藥(2)二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的基本方法：脾細(xì)胞（1×10８）骨髓瘤細(xì)胞（2×10７）混合聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)下融合，時(shí)間＜2min，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。第四章抗體制藥(2)細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備的條件:應(yīng)具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)且長(zhǎng)期穩(wěn)定。

PEG的要求：

PEG相對(duì)分子量4000，濃度為50%，二甲基亞砜（DMSO）增加融合率。第四章抗體制藥(2)細(xì)胞融合后，可產(chǎn)生多種融合。

脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞和未融合的細(xì)胞。

常用的選擇性培養(yǎng):HAT培養(yǎng)基。它是用次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)配制的。A能阻斷DNA合成的主要途徑。第四章抗體制藥(2)雜交瘤細(xì)胞篩選SP2/0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺乏株，脾細(xì)胞內(nèi)卻有這種酶，因此脾—瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。第四章抗體制藥(2)雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)的常規(guī)方法是將融合的細(xì)胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液中，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，根據(jù)情況每2-3天換液一次。換液時(shí)吸去1／2~2／3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。在融合后7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，殺死瘤—瘤融合細(xì)胞后，第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液，從融合后8~9天就可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)液上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆。第四章抗體制藥(2)第四章抗體制藥(2)在最適的培養(yǎng)條件下，大約有105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，需要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：釋放某些生長(zhǎng)刺激因子、滿(mǎn)足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴(lài)性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用的較多。第四章抗體制藥(2)

三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化

篩選陽(yáng)性克隆常用的檢測(cè)方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。

克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。第四章抗體制藥(2)ELISA用于破傷風(fēng)毒素抗體的篩選第四章抗體制藥(2)ELISA的種類(lèi)：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）。

直接ELISA、間接ELISA、雙夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、酶抗酶ELISA、雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）、單克隆捕獲ELISA（Mac-ELISA）、酶聯(lián)板吸附抗原ELISA等。

第四章抗體制藥(2)四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定?雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析。它不僅可作為鑒定的客觀指標(biāo)，還能了解分泌抗體的能力。?單克隆抗體進(jìn)行Ig類(lèi)(IgG,IgM,IgA,IgD,IgE)和亞類(lèi)鑒定，可用羊或兔抗Ig不同類(lèi)或亞類(lèi)的抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA鑒定。?特異性、親和力、純度、識(shí)別抗原的相對(duì)分子量等進(jìn)行測(cè)定。第四章抗體制藥(2)五、單克隆抗體的大量制備大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種：一種是體外培養(yǎng)法，可獲得10μg/mL的抗體；另一種是動(dòng)物體內(nèi)誘生法，可獲得5-20mg/mL的抗體。目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體。第四章抗體制藥(2)第四章抗體制藥(2)動(dòng)物體內(nèi)誘生法大量制備單克隆抗體用BALB/c小鼠降植烷腹腔雜交瘤細(xì)胞

(0.5mL)(1X106)取腹水離心上清。接種后7-12d抽取腹水，抽取幾次可達(dá)10mL。第四章抗體制藥(2)

六、單克隆抗體的純化

依單抗Ig類(lèi)和亞類(lèi)不同；用途不同應(yīng)選用不同的純化方法。用于體外診斷試劑的話，IgG類(lèi)抗體應(yīng)采用沉淀處理結(jié)合親和層析的方法，IgM類(lèi)抗體應(yīng)采用沉淀處理結(jié)合凝膠過(guò)濾的方法。若制備體內(nèi)診斷試劑或治療用藥則應(yīng)注意去除內(nèi)毒素、病毒、核酸等微量的污染物，必須經(jīng)親和層析和陰離于交換層析處理。第四章抗體制藥(2)動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備的單克隆抗體具體純化方法及一般過(guò)程：1、離心取上清，超濾，鹽析。2、分離（純化）⑴凝膠過(guò)濾：用于IgG和IgM單抗的分離純化。⑵陰離子交換層析：IgG單抗純化。⑶蛋白A親和層析：IgG單抗的純化。第四章抗體制藥(2)第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用于人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。需要對(duì)鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造，使其發(fā)揮作用和增加治療效果。

目的：降低免疫源性；降低相對(duì)分子質(zhì)量，增加組織通透性。如：人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體等人源化單抗。第四章抗體制藥(2)抗體單拷貝或IgG結(jié)構(gòu)圖鼠抗體可變區(qū)中關(guān)鍵氨基酸的分布第四章抗體制藥(2)一、人-鼠嵌合抗體抗原抗體結(jié)合功能決定于抗體V區(qū)，同種性免疫原性則決定于抗體C區(qū)。在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來(lái)，分別與人Ig的H和L鏈的C區(qū)基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)出完整的人-鼠嵌合抗體。它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合的特異性，但對(duì)人的免疫原性大幅度下降了。第四章抗體制藥(2)二、改形抗體（CDR移植抗體）ΔIg分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其它部分稱(chēng)框架區(qū)。第四章抗體制藥(2)Δ用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？贵w分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。這種改形抗體又稱(chēng)CDR移植抗體。Δ模板替換、表面重塑、補(bǔ)償變換、定位保留第四章抗體制藥(2)第四章抗體制藥(2)三、小分子抗體

基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源單抗的V區(qū)片段，相對(duì)分子質(zhì)量為原抗體的1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中的C區(qū)不表達(dá)。

小分子抗體類(lèi)型有：①Fab抗體；②FV抗體

③單鏈抗體(VH-VL)；④單域抗體（VHorVL）⑤最小識(shí)別單位(單個(gè)CDR)

第四章抗體制藥(2)☆單鏈抗體基因構(gòu)建的一般方法☆從雜交瘤細(xì)胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增抗體VH和VL基因，人工合成一條寡核苷酸序列(稱(chēng)Linker序列)，將VL的C端與VH的N端或VH的C端與VL的N端相連接，構(gòu)建成單鏈抗體基因。第四章抗體制藥(2)單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)：①可去除非特異性反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性表面蛋白，腫瘤顯象的背景更加清晰。②易滲透腫瘤組織中，增加藥物治療濃度。③免疫源性小，可消除人抗鼠的排異反應(yīng)，延長(zhǎng)在人體內(nèi)的半衰期。第四章抗體制藥(2)

單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達(dá)，有三種形式：①直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；②與其它菌體融合表達(dá)融合蛋白；③分泌表達(dá)具有功能的單鏈抗體。第四章抗體制藥(2)通過(guò)單鏈抗體的C末端連接另外單鏈抗體基因，構(gòu)建和表達(dá)雙特異單鏈抗體，可應(yīng)用于腫瘤的診斷和治療。它還可與IL—2、TNF等細(xì)胞因子基因連接，使細(xì)胞因子能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤活性，降低其毒副作用。第四章抗體制藥(2)四、雙功能抗體雙功能抗體就是雙特性抗體。它是一種非天然性抗體。其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有不同的特異性。構(gòu)建方法：⒈化學(xué)交聯(lián)法（雙功能試劑SPDP）⒉生物學(xué)方法（雜種-雜交瘤）⒊基因工程法第四章抗體制藥(2)雙功能抗體一個(gè)臂識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原，包括腫瘤相關(guān)抗原、癌基因產(chǎn)物、特殊的白細(xì)胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特異性受體等，并實(shí)施有效的結(jié)合，而另一個(gè)臂可識(shí)別免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子，如CD3、毒素、藥物等，介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、LAK細(xì)胞或毒素與藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用。雙功能抗體在治療腫瘤、自身免疫病、病毒性疾病中將會(huì)產(chǎn)生巨大的應(yīng)用價(jià)值。第四章抗體制藥(2)五、抗體融合蛋白抗體融合蛋白廣義屬雙功能抗體。

類(lèi)型：①配基-配基型融合蛋白；

②配基-Ig型嵌合蛋白；(較為成熟)③配基-FV型融合蛋白；④受體-FV型融合蛋白；⑤酶-抗體型融合蛋白。第四章抗體制藥(2)當(dāng)抗體和酶的融合蛋白定位在腫瘤部位后再給予前體藥物，其優(yōu)點(diǎn)是提高腫瘤區(qū)域的藥物濃度，降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性。該方法可使藥物濃度在腫瘤部位提高10倍，而在正常組織中降低2—3倍。第四章抗體制藥(2)構(gòu)建抗體融合蛋白的基本原則：※將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因共表達(dá)。※實(shí)踐證明在抗體的N端和C端融合其他蛋白都可以獲得成功。第四章抗體制藥(2)基因工程抗體與IL-2的融合蛋白在腫瘤治療中可特異性將IL-2的作用集中在腫瘤局部，以減少對(duì)周身的副作用?？贵w融合蛋白能特異定位于腫瘤局部，輸送高濃度的IL-2，從而充分發(fā)揮細(xì)胞因子激活的效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。第四章抗體制藥(2)酶-抗體型融合蛋白-抗體酶或催化性抗體（AbzymeorCatalyticantibody）抗體酶的制備方法1）使用與過(guò)度態(tài)結(jié)構(gòu)相似的半抗原通過(guò)雜交瘤方法生產(chǎn)；2）對(duì)抗體分子進(jìn)