《動物檢疫核酸標準物質生產者技術規(guī)范》

ICS03.120.20

CCSA00

RB

中華人民共和國認證認可行業(yè)標準

RB/TXXXXX—XXXX

動物檢疫核酸標準物質生產者技術規(guī)范

Technicalspecificationforreferencematerialproducersofnucleicacidofanimal

quarantine

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

國家認證認可監(jiān)督管理委員會發(fā)布

XX/TXXXXX—XXXX

動物檢疫核酸標準物質生產者技術規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了動物檢疫核酸標準物質生產者的結構要求，資源要求，技術和生產要求，標準物質候

選物的要求，標準物質的制備、溯源性分析、均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、定值，標準物質的文件和標簽，

標準物質的包裝與運輸，標準物質的儲存，標準物質的管理等。

本文件適用于動物檢疫核酸標準物質的生產。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T15000.2標準樣品工作導則第2部分：常用術語及定義

GB/T15000.3標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法

GB/T15000.4標準樣品工作導則第4部分：證書、標簽和附帶文件的內容

GB/T15000.7標準樣品工作導則第7部分：標準樣品生產者能力的通用要求

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27420合格評定生物樣本測量不確定度評定與表示應用指南

JJF1005標準物質通用術語和定義

JJF1265生物計量術語及定義

3術語和定義

GB/T15000.2，JJF1005，JJF1265界定的以及下列術語和定義適用于本文件。

3.1

標準物質referencematerial；RM

標準樣品referencematerial；RM

具有一種或多種規(guī)定特性足夠均勻且穩(wěn)定的材料，已被確定其符合測量過程的預期用途。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.1]

3.2

有證標準物質certifiedreferencematerial；CRM

有證標準樣品certifiedreferencematerial；CRM

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采用計量學上有效程序測定的一種或多種規(guī)定特性的標準樣品，并附有證書提供規(guī)定特性值及其不

確定度和計量溯源性的陳述。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.2]

3.3

標準物質候選物candidatereferencematerial

候選標準樣品candidatereferencematerial

擬作為標準樣品生產的材料。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.3]

3.4

最小樣本量minimumsamplesize

最小取樣量minimumsampleintake

標準樣品在測量過程中的用量下限，通常用質量表示。該取樣量可確保標準樣品文件中所描述的值

或屬性有效。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.8]

3.5

定值characterization

（標準樣品的定值）標準樣品特性值或特性屬性的測定，是生產過程的一部分。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.10]

3.6

均勻性homogeneity

標準樣品中特定部分的某個規(guī)定特性值的一致性。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.12]

3.7

穩(wěn)定性stability

標準樣品在規(guī)定條件下貯存時的特性，其某個規(guī)定特性值在規(guī)定時間內保持在規(guī)定限值范圍內。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.15]

3.8

運輸穩(wěn)定性transportationstability

標準樣品在運輸條件下送達用戶時間內特性的穩(wěn)定性。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.16]

3.9

長期穩(wěn)定性long-termstability

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在長時間內標準樣品特性的穩(wěn)定性。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.17]

3.10

有效期periodofvalidity

（標準樣品的有效期）標準樣品生產者保證標準樣品穩(wěn)定的時間區(qū)間。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.19]

3.11

特性值propertyvalue

（標準樣品的特性值）表示標準樣品的物理、化學或生物所對應特性量的值。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.2.1]

3.12

認定值certifiedvalue

標準值certifiedvalue

賦予標準樣品特性的值，其具有不確定度和計量溯源性陳述，并在標準樣品證書中標明。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.2.3]

3.13

計量溯源性metrologicaltraceability

通過具備證明文件的不間斷的校準鏈，將測量結果與參照對象聯(lián)系起來的測量結果的特性，校準鏈

中的每項校準都會引入測量不確定度。

[來源：JJF1005-2016，4.9]

3.14

標準物質證書referencematerialcertificate

標準樣品證書referencematerialcertificate

包含使用有證標準物質的基本信息，確認已采用必要的程序保證所述特性值有效性和計量溯源性的

文件。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.3.2]

3.15

標準物質生產者referencematerialproducer；RMP

標準樣品生產者referencematerialproducer；RMP

技術上有能力的機構（組織或公司、公立或私營），對其標準樣品生產的項目策劃和管理、特性值

及其不確定度的賦予和確定、特性值的批準、標準樣品證書或其他文件發(fā)布負全部責任。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.3.5]

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3.16

生產production

（標準樣品的生產）為發(fā)布和維護（有證或非有證）標準樣品開展的所有必要活動和任務。

[來源：GB/T15000.2-2019，2.3.7]

3.17

質粒plasmid

細菌細胞內一種自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子,能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外,并傳遞到子代,一般

不整合到宿主染色體上。

[來源：JJF1265-2010，4.28]

3.18

脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid（DNA）

一類帶有遺傳信息的生物大分子。有四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺苷dAMP、脫氧單磷酸鳥

嘌呤dGMP、脫氧單磷酸胞嘧啶dCMP和脫氧單磷酸胸腺嘧啶dTMP)通過3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成。它

們的組成和排列不同,顯示出不同的生物功能,如編碼功能、復制和轉錄的調控功能等。排列的變異可能

產生一系列疾病。

[來源：JJF1265-2010，4.30]

3.19

核糖核酸ribonucleicacid（RNA）

核酸的一類。由核苷酸通過3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成的多聚體。不同種類的RNA鏈長不同,行使

各式各樣的生物功能,如參加與蛋白質生物合成的RNA有信使RNA、轉移RNA和核糖體RNA;與轉錄后加工

有關的RNA有核小RNA、核仁小RNA;與生物調控有關的RNA有微RNA、干擾小RNA等。

[來源：JJF1265-2010，4.32]

3.20

核酸nucleicacid

由核苷酸或脫氧核苷酸通過3，，5，-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。具有非常重要的生物

功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）兩類。

[來源：JJF1265-2010，4.42]

3.21

聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction（PCR）

聚合酶鏈反應是一種對特定DNA片段在體外進行快速擴增的方法,由變性—退火—延伸三個基本反

應步驟構成。

[來源：JJF1265-2010，5.15]

4結構要求

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4.1標準物質生產者應符合GB/T15000.7規(guī)定的標準物質生產者能力的通用要求，應具有明確的法律

地位，建立完備的質量管理體系。

4.2標準物質生產者應具備GB/T15000.7要求的生產者能力，具備標準物質生產所必需的工作場所、

儀器設備、專業(yè)人員及管理等條件。

4.3從事動物檢疫核酸標準物質生產的場所，應符合GB19489的規(guī)定，應依據病原微生物的危害級別

進行安全控制，防止病原微生物擴散，避免在樣品制備過程中對環(huán)境造成影響。

5資源要求

5.1人員

5.1.1標準物質生產者應制定保密信息管理政策和程序，并確保所有涉及標準物質生產的人員遵守該

程序。

5.1.2標準物質生產者應制定人員教育、培訓、監(jiān)督、授權的政策和程序，并按照程序的規(guī)定對人員

進行管理。

5.1.3動物檢疫核酸標準物質生產者應確保所有依據管理體系要求從事標準物質生產的人員（包括技

術管理人員）的能力，且滿足以下條件：

a）應具有病原分子生物學相關專業(yè)的教育經歷；

b）應熟知生物安全操作知識和消毒要求，并具備實際操作技能；

c）有顏色視覺障礙的人員不能操作涉及到辨色的實驗。

5.1.4人員培訓和持續(xù)教育計劃應包括動物檢疫核酸標準物質的制備、貯存、運輸、生物安全防護、

統(tǒng)計分析等內容。

5.2設備、服務和供應品的采購

5.2.1標準物質生產者應制定對標準物質質量有影響的設備、服務和供應品進行選擇的政策和程序。

應根據程序的規(guī)定，選擇保證其生產的標準物質的質量的設備、服務和供應品。

5.2.2標準物質生產者應保存其設備、服務和供應品的購買記錄，包括所選用標準、驗收確認書和所

有調試數據的記錄。

5.2.3標準物質生產者應確保設備和耗材在經過檢驗、校準或質量驗證符合標準樣品生產的規(guī)格或要

求之后方可使用。

5.2.4動物檢疫核酸標準物質生產者應確保每一區(qū)域應有專用的儀器設備，并貼有明確的標識，以避

免設備物品從其各自的區(qū)域內移出，造成不同的工作區(qū)域間的交叉污染。

5.2.5適用時，設備和供應品要定期進行期間核查以保證其性能持續(xù)符合要求。

5.2.6動物檢疫核酸標準物質生產者應有專用的低溫儲存設備，標準物質生產材料不應與其他檢測或

科研材料混放。

5.3設施和環(huán)境條件

5.3.1標準物質生產者應確保所有場所和設施的能源、照明、濕度、溫度、壓力和通風設備應有利于

材料處置、存儲、制備、包裝等。并應防止不相容的活動、振動、氣溶膠、粉塵、微生物污染、磁場、

光和電磁場和/或電離輻射等其他環(huán)境因素的影響。

5.3.2動物檢疫核酸標準物質生產者應有相應級別的生物安全實驗室，應按照GB19489的規(guī)定使用與

生物安全等級相對應的生物危害標識。

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5.3.3動物檢疫核酸標準物質生產者的實驗室應設有分隔開的試劑配制與貯存區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸

擴增區(qū)和擴增產物分析區(qū)，無菌區(qū)域和污染區(qū)域應張貼明顯標識。應對進入和使用工作區(qū)域的人員進行

嚴格控制。不同的工作區(qū)域應使用有明顯區(qū)別標志的工作服，人員離開工作區(qū)時不得將各區(qū)特定的工作

服帶出。

6技術和生產要求

6.1生產策劃

標準物質生產者在進行生產策劃時應考慮材料的選擇；材料的加工；測量程序的選擇及確認；測量

設備的驗證和校準；均勻性、穩(wěn)定性檢驗方法選擇和經過的接受準則；定值方式的設計；特性值的賦予；

不確定度的建立及評估；計量溯源性的建立；標準物質文件的發(fā)布；貯存設施和條件；標簽、包裝和運

輸方案設計；生產后的穩(wěn)定性監(jiān)測等。

6.2標準物質候選物的選擇

6.2.1標準物質候選物的數量、純度及特性值應滿足預期用途。標準物質候選物應具有足夠的用量，

以滿足批量生產的需求。其純度應滿足均勻性和穩(wěn)定性的要求。其特性值應穩(wěn)定且在可測量范圍內，并

應經過適合性測試，如代表性、檢測靈敏度、特異性等。

6.2.2標準物質候選物應由標準物質生產機構提供或從權威實驗室獲得，并具有穩(wěn)定的獲得途徑。標

準物質候選物應具有可追溯的、詳實的來源信息記錄。應選用有效的方法驗證其真實性，必要時可由多

家權威實驗室進行聯(lián)合驗證。通過擴繁或繼代培養(yǎng)的標準物質候選物，應重新驗證其目標特性值。

6.2.3動物檢疫標準物質生產者應按照GB19489的規(guī)定，根據動物檢疫病原傳播擴散的不同特點，對

標準物質候選物進行安全控制。核酸標準物質的生產應根據病原類型在相應生物安全級別的實驗室內進

行，防止病原擴散傳播，避免對操作人員和環(huán)境造成影響。

6.3標準物質的制備

6.3.1動物檢疫核酸標準物質按照制備工藝流程和產物不同，可分為病原體滅活標準物質、病原體DNA

標準物質、病原體質粒DNA標準物質、病原體體外轉錄RNA標準物質、假病毒RNA標準物質等，具體制

備工藝流程見附錄A。

6.3.2應根據標準物質的預期用途和病原微生物的特性，選擇合理的原材料、制備方法和工藝流程。

6.3.3對目標特性值不易均勻的標準物質候選物，在制備過程中應采取必要的均勻措施。

6.3.4對目標特性值存在不穩(wěn)定因素的標準物質候選物，在制備過程中應采取必要的穩(wěn)定性措施。

6.3.5生產和存儲動物檢疫核酸標準物質的器具應確保不存在影響特性值的因子，如吸附性、滲透性、

水溶性等。

6.3.6動物檢疫核酸標準物質的分裝，應在特定條件下進行，避免生物、化學和物理方面的污染，同

一批次所有分裝單元應在同一時間完成。

6.4溯源性分析

6.4.1核酸標準物質的特性值是序列，測定方法為序列測定，溯源標準為參考序列，證據文件為

GenBank標準序列，序列測定結果文件等。

6.4.2選取的病原體應溯源至具有代表性的參考菌、毒株。

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6.4.3核酸標準物質經過PCR擴增和電泳檢測后，電泳條帶明亮清晰、條帶單一無雜帶、片段長度與

預期一致。PCR產物應經過至少3家機構測序及BLAST分析，同源性應達到特定病原的要求。

6.5均勻性檢驗

6.5.1基本要求

6.5.1.1凡成批制備并分裝成最小包裝單元的動物檢疫核酸標準物質，都應進行均勻性檢驗。均勻性

檢驗應采用相應病原的國家標準或行業(yè)標準推薦的核酸檢測方法進行，通常采用PCR、實時熒光PCR或

數字PCR等方法。

6.5.1.2所有樣品應以隨機次序在重復性條件下進行測試，即在同一實驗室中由相同的人員使用相同

的測試方法和儀器在較短時間內測試。

6.5.1.3定性（不具備數值）核酸標準物質的均勻性通過特異性條帶大小以及標準曲線的斜率和截距

進行判定。

6.5.1.4定量（具備數值）核酸標準物質可采用統(tǒng)計學方法來判定均勻性檢驗結果，統(tǒng)計學方法可按

照GB/T15000.3的規(guī)定選擇。

6.5.2取樣方式、取樣數目和最小取樣量

6.5.2.1按照GB/T15000.3的規(guī)定從分裝成最小包裝單元的樣品中抽樣。取樣應考慮引起特性值的差

異原因，從特性值可能出現差異的部位抽取，抽取的單元分布應有足夠的代表性。當引起特性值的差異

原因未知或認為不存在差異時，可先將樣品順序編碼，采用隨機數表決定抽取樣品的號碼。

6.5.2.2當總體單元數少于等于200時，抽取單元數不少于11個；當總體單元數多于200但少于等于

500時，抽取單元數不少于15個；當總體單元數大于500但少于等于1000時，抽取單元數不少于25

個；當總體單元數大于1000時，抽取單元數不少于30個。對于均勻性好的樣品，當總體單元數少于等

于500時，抽取單元數不少于10個；當總體單元數大于500時，抽取單元數不少于15個。

6.5.2.3最小取樣量多少是由用來檢驗均勻性所采用的方法決定的，一旦最小取樣量確定，該標準物

質定值和使用時都應保證用量不少于該最小取樣量。

6.5.3結果判定

6.5.3.1定性（不具備數值）標準物質以擴增的特異性條帶大小的一致性，以及標準曲線的斜率和截

距的一致性進行判定。

——若擴增的特異性條帶大小一致且標準曲線的斜率和截距一致，則樣品均勻；

——若擴增的特異性條帶大小、標準曲線的斜率和截距任何一項不一致，則樣品不均勻。

6.5.3.2定量（具備數值）標準物質采用適用的統(tǒng)計方法進行分析，得到統(tǒng)計值并與統(tǒng)計值分布表上

的臨界值進行比較。

——若統(tǒng)計值小于臨界值，表示無顯著性差異，則樣品均勻；

——若統(tǒng)計值大于臨界值，表示有顯著性差異，則樣品不均勻。

6.6穩(wěn)定性檢驗

6.6.1基本要求

6.6.1.1動物檢疫核酸標準物質在規(guī)定的保存或使用條件下，應定期進行特性值的穩(wěn)定性檢驗。穩(wěn)定

性檢驗應在均勻性檢驗證明樣品均勻性后進行。穩(wěn)定性檢驗所用人員、儀器、測試方法和實驗室都應與

均勻性檢驗相同。

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6.6.1.2標準物質有效期應不少于1年。保存期間需要對動物檢疫核酸標準物質的穩(wěn)定性條件進行連

續(xù)監(jiān)測。在預期有效期間應有多個時間間隔的穩(wěn)定性檢驗數據，同時記錄穩(wěn)定性檢驗期間的環(huán)境條件。

6.6.2溫度和時間間隔

6.6.2.1運輸穩(wěn)定性測定溫度為4℃、25℃，測定時間點為0周、1周、2周、4周等。

6.6.2.2長期穩(wěn)定性測定溫度為-20℃和-80℃，測定時間點為0月、1月、2月、3月、6月、9月、

12月、18月、24月等。

6.6.3樣品的抽取

穩(wěn)定性檢驗所用樣品應從最小包裝單元的樣品中隨機抽取。當標準物質有多個待定特性值時，應選

擇那些易變的和有代表性的特性值進行穩(wěn)定性檢驗。

6.6.4結果評價

分裝成最小包裝后的樣品按時間順序進行測量，可依據GB/T15000.3的規(guī)定選擇適用的統(tǒng)計方法

進行穩(wěn)定性檢驗結果評價。如測量結果在隨機不確定度范圍內波動，則該特性值在試驗的時間間隔內是

穩(wěn)定的。

6.7定值

6.7.1基本要求

6.7.1.1經過均勻性、穩(wěn)定性檢驗合格并具有一定數量的標準物質方可進行定值。

6.7.1.2動物檢疫核酸標準物質應采用多個機構合作定值的方式對標準物質的特性值進行確定。參與

合作定值的機構應具有技術權威性，并具有必備的環(huán)境和設施條件及所需的技術能力和經驗。定值過程

所用量具和儀器，應在檢定/校準合格的有效期內。

6.7.2定值方法

6.7.2.1可采用一種或多種準確可靠的方法對標準物質的特性值進行測量。當采用同一種定值測量方

法時，獨立定值實驗室數一般不少于8個；當采用多種定值測量方法時，獨立定值實驗室數一般不少于

6個。

6.7.2.2定性標準物質特性值為特定核酸序列。核酸標準物質經過PCR擴增和電泳檢測后，電泳條帶

明亮清晰、條帶單一無雜帶、片段長度與預期一致。PCR產物應經過至少3家機構測序及BLAST分析，

同源性應達到特定病原的要求。參與合作定值的所有結果應保持定性水平上的一致。

6.7.2.3定量標準物質特性值為特定核酸含量。不同機構的合作定值結果應選取適宜的統(tǒng)計學方法進

行檢驗。可進行格拉布斯（Grubbs）檢驗法或夏皮羅-威爾克（Shapiro-Wilk）檢驗法等進行正態(tài)分布

檢驗，在從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的情況下，再將每個機構的測定數值的平均值視為單次測量值，構

成一組新的測量數據，進行格拉布斯（Grubbs）檢驗法檢驗，剔除離群值后將該組數據的平均值作為認

定值。對非正態(tài)分布的數據以中間值定值。

6.8總不確定度的評估

6.8.1總不確定度的評定方法應按照GB/T27420中的有關技術及文書要求進行。

6.8.2認定值的總不確定量來源包括通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置性水平按統(tǒng)計

方法計算得出；通過對測量影響參數和影響函數的分析、估計得出；樣品不均勻和樣品在有效期內的變

動性所引起的不確定度等。

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7標準物質的文件和標簽

7.1標準物質生產者應為有證標準物質發(fā)布提供標準物質證書，并為其他標準物質發(fā)布提供產品說明

書。

7.2標準物質證書和產品說明書應至少包括文件標題；標準物質的唯一性標識；標準物質的名稱；標

準物質生產者的名稱和聯(lián)系信息；預期用途；最小取樣量；有效期；儲存信息；充分確保標準物質完整

性的處置與使用說明。標準物質證書還應包括有證標準物質的一般描述；特性值和相關不確定度；由程

序定義的被測量的測量程序；標準值的計量溯源性；標準物質生產者批準人的姓名和職務。

7.3標準物質標簽應牢固地粘貼在標準物質獨立包裝單元的產品容器上，并應在標準物質的有效期內，

在規(guī)定的儲存和處置條件下保持清晰和完整。標簽應標明標準物質、生產者、批次及其他必要的信息，

使得標準物質能夠被唯一識別和引用。當標準物質包裝單元的實際尺寸限制了標簽上的信息量時，這些

信息應包含在標準物質文件中，包裝單元上應給出標準物質的唯一標識符。

8標準物質的包裝與運輸

8.1標準物質的包裝應具有良好的密封性。根據動物檢疫核酸標準物質的不同病原特性選擇合適的包

裝容器，例如，可采用避光、抽真空、防潮或惰性氣體包裝，以確保包裝不對標準物質的特性值產生不

良影響。

8.2動物檢疫核酸標準物質應保證低溫運輸，同時對于玻璃容器應有能夠提供緩沖的外包裝，并寫有

“易碎品”字樣。

9標準物質的儲存

9.1標準物質生產者應確保標準物質有專門的儲存場所或冰箱，并與化學試劑和其他用途材料隔離。

9.2密封后的動物檢疫核酸標準物質應置于-20℃或-80℃儲存，儲存條件應與穩(wěn)定性檢驗條件一致。

9.3應對儲存標準物質的環(huán)境進行監(jiān)控（如溫濕度），保證儲存環(huán)境條件的符合性及持續(xù)性。

10標準物質的管理

10.1動物檢疫核酸標準物質制備完成后應對其實施合理有效地管理。

10.2應對在儲存期內的動物檢疫核酸標準物質進行檢查，應對標準物質在整個儲存期間的狀況進行定

期評估。當發(fā)生動物檢疫核酸標準物質過期、變質、包裝破裂、標簽破損等情況時，應及時將其從存放

處撤除，并用合適的方式處理，以免誤用。

10.3標準物質生產者應建立標準物質外部評價程序，以確保所生產標準物質的質量。評價至少包括證

書規(guī)范評價和其特性值評價。證書規(guī)范性評價應按照GB/T15000.4、GB/T15000.7和我國標準物質管

理辦法進行。特性值的評價應包括測量值、穩(wěn)定性及均勻性。以上評價獨立測量數目應不少于6個。

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附錄A

（資料性）

A.1病原體滅活標準物質的制備

A.1.1工藝流程（見圖A.1）

圖A.1病原體滅活標準物質制備工藝流程圖

A.1.2病原體的選擇、鑒定和增殖

根據本文件6.2條所規(guī)定的原則選取病原體，采用標準方法進行分離、純化、培養(yǎng)、生化鑒定和特

異性基因片段的PCR或實時熒光PCR檢測，結果符合預期的病原體使用相應的標準方法進行增殖。

A.1.3樣品的制備及滅活

選取適當的接種比例，將病原體接種到培養(yǎng)基（細菌）或細胞培養(yǎng)液（病毒）中，在標準方法規(guī)定

的條件下培養(yǎng)并收集純化增值后的病原體。根據病原體特性選取適宜的物理或化學方法進行滅活，滅活

后離心取上清，并采用適當的方法對滅活效果進行評價。

A.1.4初步定值、分裝和保存

提取滅活病原體DNA或RNA，并使用已知拷貝數的外標品，通過實時定量外標法經線性回歸分析，獲

得滅活病原體DNA或RNA的拷貝數。根據定值結果，用核酸保存液將滅活病原體離心取上清的產物稀釋至

8

10Copies/μL，充分混勻后分裝入凍存管中，加貼唯一性標識后，置-80℃保存。

A.2病原體DNA標準物質的制備

A.2.1工藝流程（見圖A.2）

13

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圖A.2病原體DNA標準物質制備工藝流程圖

A.2.2病原體的選擇、鑒定和增殖

同A.1.2。

A.2.3病原體DNA的提取和純化

病原體DNA選用標準方法進行，DNA提取物溶解在pH8.0的TE緩沖液中，并在-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｓ?/p>

于制備病原體DNA標準物質的DNA相對分子質量應盡可能大，因此核酸提取過程中操作盡可能溫和，提取

過程盡量在低溫下進行。另外，制備的病原體DNA必須是高純度的，沒有蛋白質和RNA污染，各種離子濃

度也應符合要求，提取過程中使用的玻璃器皿、試劑、離心管等一次性用品都應經過嚴格滅菌消毒。

A.2.4核酸純度的檢測

采用分光光度計法測試DNA在260nm和280nm下的吸光度，以OD260/OD280的比值來判斷提取的DNA純

度。如果OD260/OD280在1.7～2.0之間，表明所提取的DNA較純；當OD260/OD280<1.7時，說明所提取的DNA有

蛋白質污染；OD260/OD280>2.0時，說明提取的DNA有RNA污染。在提取的DNA不純時，應重新提取。

A.2.5初步定值、分裝和保存

使用已知拷貝數的外標品，通過實時定量外標法經線性回歸分析，獲得滅活病原體DNA的拷貝數。

8

根據定值結果，用核酸保存液將滅活病原體離心取上清的產物稀釋至10Copies/μL，充分混勻后分裝入

凍存管中，加貼唯一性標識后，置-80℃保存。

A.3病原體質粒DNA標準物質的制備

A.3.1工藝流程（見圖A.3）

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圖A.3病原體質粒DNA標準物質制備工藝流程圖

A.3.2病原體的選擇、鑒定和增殖

同A.1.2。

A.3.3質粒的構建

將病原體滅活后，進行基因擴增。應選擇具有檢測或分型意義的基因片段，選擇的基因片段應足夠

長，應涵蓋一般檢測方法和試劑的檢測范圍。獲得的擴增產物進行純化后連接到載體上，然后轉化大腸

桿菌感受態(tài)細胞。PCR驗證挑選陽性克隆，對插入片段進行測序確認，確保序列無突變，與已知序列完

全一致。

A.3.4質粒DNA純度檢測及初步定值

將測序正確的陽性克隆菌落大量培養(yǎng)，采用標準方法提取質粒DNA，采用紫外分光光度計法測試DNA

在260nm和280nm下的吸光度，以OD260/OD280的比值來判斷提取的質粒DNA純度。如果OD260/OD280在1.8～2.0

之間，表明所提取的DNA較純；當OD260/OD280<1.8時，說明所提取的DNA有蛋白質污染；OD260/OD280>2.0時，

說明提取的DNA有RNA污染。若提取的DNA不純，應重新提取。

質粒DNA濃度按照公式（A.1）計算，并根據質粒DNA分子量，按照公式（A.2）換算為Copies/μL。

DNA濃度（μg/mL）=OD260nm×50μg/mL×稀釋倍數（A.1）

-114

DNA濃度（Copies/μL）=OD260nm×50×M.W.×6.02×10×稀釋倍數（A.2）

A.3.5稀釋、分裝和保存

8

根據初步定值結果，用核酸保存液將制備好的質粒DNA稀釋至10Copies/μL，充分混勻后分裝入凍存

管中，加貼唯一性標識后，置-80℃保存。

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A.4病原體體外轉錄RNA標準物質的制備

A.4.1工藝流程（見圖A.4）

圖A.4病原體RNA標準物質制備工藝流程圖

A.4.2病原體的選擇、鑒定和增殖

同A.1.2。

A.4.3質粒的構建

同A.3.3。

A.4.4病原體RNA的體外轉錄

將純化后的質粒用適當的限制性內切酶進行酶切。T7（或SP6）啟動子與插入片段以及插入片段中

間不應有此限制性內切酶作用的酶切位點，而且酶切后的末端不形成5’懸掛。獲得的線性化片段進行體

外轉錄，對獲得的體外轉錄產物進行純化。使用脫氧核糖核酸酶DNase除去其中的DNA模板，使用TRIZOL

再次抽提RNA，即得到體外轉錄病毒RNA母液。

A.4.5體外轉錄RNA純度檢測及初步定值

采用紫外分光光度計法測試RNA在260nm和280nm下的吸光度，以OD260/OD280的比值來判斷體外轉錄

RNA純度。要求OD260/OD280在1.9～2.1之間。RNA濃度按照公式（A.3）計算，并根據RNA分子量，按照

公式（A.4）換算為Copies/μL。

RNA濃度（μg/mL）=OD260nm×40μg/mL×稀釋倍數（A.3）

RNA濃度（Copies/μL）=OD260nm×40×M.W.-1×6.02×1014×稀釋倍數（A.4）