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文檔簡介
ICS03.120.20
CCSA00
RB
中華人民共和國認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
RB/TXXXXX—XXXX
動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者技術(shù)規(guī)范
Technicalspecificationforreferencematerialproducersofnucleicacidofanimal
quarantine
(征求意見稿)
XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施
國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會發(fā)布
XX/TXXXXX—XXXX
動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者技術(shù)規(guī)范
1范圍
本文件規(guī)定了動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者的結(jié)構(gòu)要求,資源要求,技術(shù)和生產(chǎn)要求,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候
選物的要求,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、溯源性分析、均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、定值,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的文件和標(biāo)簽,
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與運輸,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲存,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的管理等。
本文件適用于動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,
僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本
文件。
GB/T15000.2標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第2部分:常用術(shù)語及定義
GB/T15000.3標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法
GB/T15000.4標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第4部分:證書、標(biāo)簽和附帶文件的內(nèi)容
GB/T15000.7標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第7部分:標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力的通用要求
GB19489實驗室生物安全通用要求
GB/T27420合格評定生物樣本測量不確定度評定與表示應(yīng)用指南
JJF1005標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通用術(shù)語和定義
JJF1265生物計量術(shù)語及定義
3術(shù)語和定義
GB/T15000.2,JJF1005,JJF1265界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。
3.1
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)referencematerial;RM
標(biāo)準(zhǔn)樣品referencematerial;RM
具有一種或多種規(guī)定特性足夠均勻且穩(wěn)定的材料,已被確定其符合測量過程的預(yù)期用途。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.1]
3.2
有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)certifiedreferencematerial;CRM
有證標(biāo)準(zhǔn)樣品certifiedreferencematerial;CRM
4
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采用計量學(xué)上有效程序測定的一種或多種規(guī)定特性的標(biāo)準(zhǔn)樣品,并附有證書提供規(guī)定特性值及其不
確定度和計量溯源性的陳述。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.2]
3.3
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物candidatereferencematerial
候選標(biāo)準(zhǔn)樣品candidatereferencematerial
擬作為標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)的材料。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.3]
3.4
最小樣本量minimumsamplesize
最小取樣量minimumsampleintake
標(biāo)準(zhǔn)樣品在測量過程中的用量下限,通常用質(zhì)量表示。該取樣量可確保標(biāo)準(zhǔn)樣品文件中所描述的值
或?qū)傩杂行А?/p>
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.8]
3.5
定值characterization
(標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值)標(biāo)準(zhǔn)樣品特性值或特性屬性的測定,是生產(chǎn)過程的一部分。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.10]
3.6
均勻性homogeneity
標(biāo)準(zhǔn)樣品中特定部分的某個規(guī)定特性值的一致性。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.12]
3.7
穩(wěn)定性stability
標(biāo)準(zhǔn)樣品在規(guī)定條件下貯存時的特性,其某個規(guī)定特性值在規(guī)定時間內(nèi)保持在規(guī)定限值范圍內(nèi)。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.15]
3.8
運輸穩(wěn)定性transportationstability
標(biāo)準(zhǔn)樣品在運輸條件下送達(dá)用戶時間內(nèi)特性的穩(wěn)定性。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.16]
3.9
長期穩(wěn)定性long-termstability
5
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在長時間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品特性的穩(wěn)定性。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.17]
3.10
有效期periodofvalidity
(標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期)標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者保證標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定的時間區(qū)間。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.1.19]
3.11
特性值propertyvalue
(標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值)表示標(biāo)準(zhǔn)樣品的物理、化學(xué)或生物所對應(yīng)特性量的值。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.2.1]
3.12
認(rèn)定值certifiedvalue
標(biāo)準(zhǔn)值certifiedvalue
賦予標(biāo)準(zhǔn)樣品特性的值,其具有不確定度和計量溯源性陳述,并在標(biāo)準(zhǔn)樣品證書中標(biāo)明。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.2.3]
3.13
計量溯源性metrologicaltraceability
通過具備證明文件的不間斷的校準(zhǔn)鏈,將測量結(jié)果與參照對象聯(lián)系起來的測量結(jié)果的特性,校準(zhǔn)鏈
中的每項校準(zhǔn)都會引入測量不確定度。
[來源:JJF1005-2016,4.9]
3.14
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書referencematerialcertificate
標(biāo)準(zhǔn)樣品證書referencematerialcertificate
包含使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本信息,確認(rèn)已采用必要的程序保證所述特性值有效性和計量溯源性的
文件。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.3.2]
3.15
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者referencematerialproducer;RMP
標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者referencematerialproducer;RMP
技術(shù)上有能力的機(jī)構(gòu)(組織或公司、公立或私營),對其標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)的項目策劃和管理、特性值
及其不確定度的賦予和確定、特性值的批準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)樣品證書或其他文件發(fā)布負(fù)全部責(zé)任。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.3.5]
6
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3.16
生產(chǎn)production
(標(biāo)準(zhǔn)樣品的生產(chǎn))為發(fā)布和維護(hù)(有證或非有證)標(biāo)準(zhǔn)樣品開展的所有必要活動和任務(wù)。
[來源:GB/T15000.2-2019,2.3.7]
3.17
質(zhì)粒plasmid
細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子,能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外,并傳遞到子代,一般
不整合到宿主染色體上。
[來源:JJF1265-2010,4.28]
3.18
脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid(DNA)
一類帶有遺傳信息的生物大分子。有四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺苷dAMP、脫氧單磷酸鳥
嘌呤dGMP、脫氧單磷酸胞嘧啶dCMP和脫氧單磷酸胸腺嘧啶dTMP)通過3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成。它
們的組成和排列不同,顯示出不同的生物功能,如編碼功能、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控功能等。排列的變異可能
產(chǎn)生一系列疾病。
[來源:JJF1265-2010,4.30]
3.19
核糖核酸ribonucleicacid(RNA)
核酸的一類。由核苷酸通過3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成的多聚體。不同種類的RNA鏈長不同,行使
各式各樣的生物功能,如參加與蛋白質(zhì)生物合成的RNA有信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA和核糖體RNA;與轉(zhuǎn)錄后加工
有關(guān)的RNA有核小RNA、核仁小RNA;與生物調(diào)控有關(guān)的RNA有微RNA、干擾小RNA等。
[來源:JJF1265-2010,4.32]
3.20
核酸nucleicacid
由核苷酸或脫氧核苷酸通過3,,5,-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。具有非常重要的生物
功能,主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩類。
[來源:JJF1265-2010,4.42]
3.21
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction(PCR)
聚合酶鏈反應(yīng)是一種對特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法,由變性—退火—延伸三個基本反
應(yīng)步驟構(gòu)成。
[來源:JJF1265-2010,5.15]
4結(jié)構(gòu)要求
7
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4.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)符合GB/T15000.7規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者能力的通用要求,應(yīng)具有明確的法律
地位,建立完備的質(zhì)量管理體系。
4.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)具備GB/T15000.7要求的生產(chǎn)者能力,具備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)所必需的工作場所、
儀器設(shè)備、專業(yè)人員及管理等條件。
4.3從事動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)的場所,應(yīng)符合GB19489的規(guī)定,應(yīng)依據(jù)病原微生物的危害級別
進(jìn)行安全控制,防止病原微生物擴(kuò)散,避免在樣品制備過程中對環(huán)境造成影響。
5資源要求
5.1人員
5.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)制定保密信息管理政策和程序,并確保所有涉及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)的人員遵守該
程序。
5.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)制定人員教育、培訓(xùn)、監(jiān)督、授權(quán)的政策和程序,并按照程序的規(guī)定對人員
進(jìn)行管理。
5.1.3動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保所有依據(jù)管理體系要求從事標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)的人員(包括技
術(shù)管理人員)的能力,且滿足以下條件:
a)應(yīng)具有病原分子生物學(xué)相關(guān)專業(yè)的教育經(jīng)歷;
b)應(yīng)熟知生物安全操作知識和消毒要求,并具備實際操作技能;
c)有顏色視覺障礙的人員不能操作涉及到辨色的實驗。
5.1.4人員培訓(xùn)和持續(xù)教育計劃應(yīng)包括動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、貯存、運輸、生物安全防護(hù)、
統(tǒng)計分析等內(nèi)容。
5.2設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品的采購
5.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)制定對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量有影響的設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品進(jìn)行選擇的政策和程序。
應(yīng)根據(jù)程序的規(guī)定,選擇保證其生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量的設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品。
5.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)保存其設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品的購買記錄,包括所選用標(biāo)準(zhǔn)、驗收確認(rèn)書和所
有調(diào)試數(shù)據(jù)的記錄。
5.2.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保設(shè)備和耗材在經(jīng)過檢驗、校準(zhǔn)或質(zhì)量驗證符合標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)的規(guī)格或要
求之后方可使用。
5.2.4動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保每一區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備,并貼有明確的標(biāo)識,以避
免設(shè)備物品從其各自的區(qū)域內(nèi)移出,造成不同的工作區(qū)域間的交叉污染。
5.2.5適用時,設(shè)備和供應(yīng)品要定期進(jìn)行期間核查以保證其性能持續(xù)符合要求。
5.2.6動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)有專用的低溫儲存設(shè)備,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)材料不應(yīng)與其他檢測或
科研材料混放。
5.3設(shè)施和環(huán)境條件
5.3.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保所有場所和設(shè)施的能源、照明、濕度、溫度、壓力和通風(fēng)設(shè)備應(yīng)有利于
材料處置、存儲、制備、包裝等。并應(yīng)防止不相容的活動、振動、氣溶膠、粉塵、微生物污染、磁場、
光和電磁場和/或電離輻射等其他環(huán)境因素的影響。
5.3.2動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)有相應(yīng)級別的生物安全實驗室,應(yīng)按照GB19489的規(guī)定使用與
生物安全等級相對應(yīng)的生物危害標(biāo)識。
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5.3.3動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者的實驗室應(yīng)設(shè)有分隔開的試劑配制與貯存區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸
擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),無菌區(qū)域和污染區(qū)域應(yīng)張貼明顯標(biāo)識。應(yīng)對進(jìn)入和使用工作區(qū)域的人員進(jìn)行
嚴(yán)格控制。不同的工作區(qū)域應(yīng)使用有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服,人員離開工作區(qū)時不得將各區(qū)特定的工作
服帶出。
6技術(shù)和生產(chǎn)要求
6.1生產(chǎn)策劃
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者在進(jìn)行生產(chǎn)策劃時應(yīng)考慮材料的選擇;材料的加工;測量程序的選擇及確認(rèn);測量
設(shè)備的驗證和校準(zhǔn);均勻性、穩(wěn)定性檢驗方法選擇和經(jīng)過的接受準(zhǔn)則;定值方式的設(shè)計;特性值的賦予;
不確定度的建立及評估;計量溯源性的建立;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)文件的發(fā)布;貯存設(shè)施和條件;標(biāo)簽、包裝和運
輸方案設(shè)計;生產(chǎn)后的穩(wěn)定性監(jiān)測等。
6.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的選擇
6.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的數(shù)量、純度及特性值應(yīng)滿足預(yù)期用途。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物應(yīng)具有足夠的用量,
以滿足批量生產(chǎn)的需求。其純度應(yīng)滿足均勻性和穩(wěn)定性的要求。其特性值應(yīng)穩(wěn)定且在可測量范圍內(nèi),并
應(yīng)經(jīng)過適合性測試,如代表性、檢測靈敏度、特異性等。
6.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物應(yīng)由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)機(jī)構(gòu)提供或從權(quán)威實驗室獲得,并具有穩(wěn)定的獲得途徑。標(biāo)
準(zhǔn)物質(zhì)候選物應(yīng)具有可追溯的、詳實的來源信息記錄。應(yīng)選用有效的方法驗證其真實性,必要時可由多
家權(quán)威實驗室進(jìn)行聯(lián)合驗證。通過擴(kuò)繁或繼代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物,應(yīng)重新驗證其目標(biāo)特性值。
6.2.3動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)按照GB19489的規(guī)定,根據(jù)動物檢疫病原傳播擴(kuò)散的不同特點,對
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行安全控制。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)應(yīng)根據(jù)病原類型在相應(yīng)生物安全級別的實驗室內(nèi)進(jìn)
行,防止病原擴(kuò)散傳播,避免對操作人員和環(huán)境造成影響。
6.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備
6.3.1動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照制備工藝流程和產(chǎn)物不同,可分為病原體滅活標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、病原體DNA
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、病原體質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、病原體體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、假病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等,具體制
備工藝流程見附錄A。
6.3.2應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的預(yù)期用途和病原微生物的特性,選擇合理的原材料、制備方法和工藝流程。
6.3.3對目標(biāo)特性值不易均勻的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物,在制備過程中應(yīng)采取必要的均勻措施。
6.3.4對目標(biāo)特性值存在不穩(wěn)定因素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物,在制備過程中應(yīng)采取必要的穩(wěn)定性措施。
6.3.5生產(chǎn)和存儲動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的器具應(yīng)確保不存在影響特性值的因子,如吸附性、滲透性、
水溶性等。
6.3.6動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分裝,應(yīng)在特定條件下進(jìn)行,避免生物、化學(xué)和物理方面的污染,同
一批次所有分裝單元應(yīng)在同一時間完成。
6.4溯源性分析
6.4.1核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值是序列,測定方法為序列測定,溯源標(biāo)準(zhǔn)為參考序列,證據(jù)文件為
GenBank標(biāo)準(zhǔn)序列,序列測定結(jié)果文件等。
6.4.2選取的病原體應(yīng)溯源至具有代表性的參考菌、毒株。
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6.4.3核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過PCR擴(kuò)增和電泳檢測后,電泳條帶明亮清晰、條帶單一無雜帶、片段長度與
預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)過至少3家機(jī)構(gòu)測序及BLAST分析,同源性應(yīng)達(dá)到特定病原的要求。
6.5均勻性檢驗
6.5.1基本要求
6.5.1.1凡成批制備并分裝成最小包裝單元的動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),都應(yīng)進(jìn)行均勻性檢驗。均勻性
檢驗應(yīng)采用相應(yīng)病原的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的核酸檢測方法進(jìn)行,通常采用PCR、實時熒光PCR或
數(shù)字PCR等方法。
6.5.1.2所有樣品應(yīng)以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下進(jìn)行測試,即在同一實驗室中由相同的人員使用相同
的測試方法和儀器在較短時間內(nèi)測試。
6.5.1.3定性(不具備數(shù)值)核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性通過特異性條帶大小以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距
進(jìn)行判定。
6.5.1.4定量(具備數(shù)值)核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可采用統(tǒng)計學(xué)方法來判定均勻性檢驗結(jié)果,統(tǒng)計學(xué)方法可按
照GB/T15000.3的規(guī)定選擇。
6.5.2取樣方式、取樣數(shù)目和最小取樣量
6.5.2.1按照GB/T15000.3的規(guī)定從分裝成最小包裝單元的樣品中抽樣。取樣應(yīng)考慮引起特性值的差
異原因,從特性值可能出現(xiàn)差異的部位抽取,抽取的單元分布應(yīng)有足夠的代表性。當(dāng)引起特性值的差異
原因未知或認(rèn)為不存在差異時,可先將樣品順序編碼,采用隨機(jī)數(shù)表決定抽取樣品的號碼。
6.5.2.2當(dāng)總體單元數(shù)少于等于200時,抽取單元數(shù)不少于11個;當(dāng)總體單元數(shù)多于200但少于等于
500時,抽取單元數(shù)不少于15個;當(dāng)總體單元數(shù)大于500但少于等于1000時,抽取單元數(shù)不少于25
個;當(dāng)總體單元數(shù)大于1000時,抽取單元數(shù)不少于30個。對于均勻性好的樣品,當(dāng)總體單元數(shù)少于等
于500時,抽取單元數(shù)不少于10個;當(dāng)總體單元數(shù)大于500時,抽取單元數(shù)不少于15個。
6.5.2.3最小取樣量多少是由用來檢驗均勻性所采用的方法決定的,一旦最小取樣量確定,該標(biāo)準(zhǔn)物
質(zhì)定值和使用時都應(yīng)保證用量不少于該最小取樣量。
6.5.3結(jié)果判定
6.5.3.1定性(不具備數(shù)值)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以擴(kuò)增的特異性條帶大小的一致性,以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截
距的一致性進(jìn)行判定。
——若擴(kuò)增的特異性條帶大小一致且標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距一致,則樣品均勻;
——若擴(kuò)增的特異性條帶大小、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距任何一項不一致,則樣品不均勻。
6.5.3.2定量(具備數(shù)值)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用適用的統(tǒng)計方法進(jìn)行分析,得到統(tǒng)計值并與統(tǒng)計值分布表上
的臨界值進(jìn)行比較。
——若統(tǒng)計值小于臨界值,表示無顯著性差異,則樣品均勻;
——若統(tǒng)計值大于臨界值,表示有顯著性差異,則樣品不均勻。
6.6穩(wěn)定性檢驗
6.6.1基本要求
6.6.1.1動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在規(guī)定的保存或使用條件下,應(yīng)定期進(jìn)行特性值的穩(wěn)定性檢驗。穩(wěn)定
性檢驗應(yīng)在均勻性檢驗證明樣品均勻性后進(jìn)行。穩(wěn)定性檢驗所用人員、儀器、測試方法和實驗室都應(yīng)與
均勻性檢驗相同。
10
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6.6.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有效期應(yīng)不少于1年。保存期間需要對動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性條件進(jìn)行連
續(xù)監(jiān)測。在預(yù)期有效期間應(yīng)有多個時間間隔的穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù),同時記錄穩(wěn)定性檢驗期間的環(huán)境條件。
6.6.2溫度和時間間隔
6.6.2.1運輸穩(wěn)定性測定溫度為4℃、25℃,測定時間點為0周、1周、2周、4周等。
6.6.2.2長期穩(wěn)定性測定溫度為-20℃和-80℃,測定時間點為0月、1月、2月、3月、6月、9月、
12月、18月、24月等。
6.6.3樣品的抽取
穩(wěn)定性檢驗所用樣品應(yīng)從最小包裝單元的樣品中隨機(jī)抽取。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有多個待定特性值時,應(yīng)選
擇那些易變的和有代表性的特性值進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗。
6.6.4結(jié)果評價
分裝成最小包裝后的樣品按時間順序進(jìn)行測量,可依據(jù)GB/T15000.3的規(guī)定選擇適用的統(tǒng)計方法
進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗結(jié)果評價。如測量結(jié)果在隨機(jī)不確定度范圍內(nèi)波動,則該特性值在試驗的時間間隔內(nèi)是
穩(wěn)定的。
6.7定值
6.7.1基本要求
6.7.1.1經(jīng)過均勻性、穩(wěn)定性檢驗合格并具有一定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方可進(jìn)行定值。
6.7.1.2動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)采用多個機(jī)構(gòu)合作定值的方式對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行確定。參與
合作定值的機(jī)構(gòu)應(yīng)具有技術(shù)權(quán)威性,并具有必備的環(huán)境和設(shè)施條件及所需的技術(shù)能力和經(jīng)驗。定值過程
所用量具和儀器,應(yīng)在檢定/校準(zhǔn)合格的有效期內(nèi)。
6.7.2定值方法
6.7.2.1可采用一種或多種準(zhǔn)確可靠的方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行測量。當(dāng)采用同一種定值測量方
法時,獨立定值實驗室數(shù)一般不少于8個;當(dāng)采用多種定值測量方法時,獨立定值實驗室數(shù)一般不少于
6個。
6.7.2.2定性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值為特定核酸序列。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過PCR擴(kuò)增和電泳檢測后,電泳條帶
明亮清晰、條帶單一無雜帶、片段長度與預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)過至少3家機(jī)構(gòu)測序及BLAST分析,
同源性應(yīng)達(dá)到特定病原的要求。參與合作定值的所有結(jié)果應(yīng)保持定性水平上的一致。
6.7.2.3定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值為特定核酸含量。不同機(jī)構(gòu)的合作定值結(jié)果應(yīng)選取適宜的統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)
行檢驗??蛇M(jìn)行格拉布斯(Grubbs)檢驗法或夏皮羅-威爾克(Shapiro-Wilk)檢驗法等進(jìn)行正態(tài)分布
檢驗,在從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的情況下,再將每個機(jī)構(gòu)的測定數(shù)值的平均值視為單次測量值,構(gòu)
成一組新的測量數(shù)據(jù),進(jìn)行格拉布斯(Grubbs)檢驗法檢驗,剔除離群值后將該組數(shù)據(jù)的平均值作為認(rèn)
定值。對非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中間值定值。
6.8總不確定度的評估
6.8.1總不確定度的評定方法應(yīng)按照GB/T27420中的有關(guān)技術(shù)及文書要求進(jìn)行。
6.8.2認(rèn)定值的總不確定量來源包括通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置性水平按統(tǒng)計
方法計算得出;通過對測量影響參數(shù)和影響函數(shù)的分析、估計得出;樣品不均勻和樣品在有效期內(nèi)的變
動性所引起的不確定度等。
11
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7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的文件和標(biāo)簽
7.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)布提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書,并為其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)布提供產(chǎn)品說明
書。
7.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書和產(chǎn)品說明書應(yīng)至少包括文件標(biāo)題;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的唯一性標(biāo)識;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的名稱;標(biāo)
準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者的名稱和聯(lián)系信息;預(yù)期用途;最小取樣量;有效期;儲存信息;充分確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)完整
性的處置與使用說明。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書還應(yīng)包括有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一般描述;特性值和相關(guān)不確定度;由程
序定義的被測量的測量程序;標(biāo)準(zhǔn)值的計量溯源性;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者批準(zhǔn)人的姓名和職務(wù)。
7.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)簽應(yīng)牢固地粘貼在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獨立包裝單元的產(chǎn)品容器上,并應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期內(nèi),
在規(guī)定的儲存和處置條件下保持清晰和完整。標(biāo)簽應(yīng)標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、生產(chǎn)者、批次及其他必要的信息,
使得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠被唯一識別和引用。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包裝單元的實際尺寸限制了標(biāo)簽上的信息量時,這些
信息應(yīng)包含在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)文件中,包裝單元上應(yīng)給出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的唯一標(biāo)識符。
8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與運輸
8.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝應(yīng)具有良好的密封性。根據(jù)動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不同病原特性選擇合適的包
裝容器,例如,可采用避光、抽真空、防潮或惰性氣體包裝,以確保包裝不對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值產(chǎn)生不
良影響。
8.2動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)保證低溫運輸,同時對于玻璃容器應(yīng)有能夠提供緩沖的外包裝,并寫有
“易碎品”字樣。
9標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲存
9.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有專門的儲存場所或冰箱,并與化學(xué)試劑和其他用途材料隔離。
9.2密封后的動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)置于-20℃或-80℃儲存,儲存條件應(yīng)與穩(wěn)定性檢驗條件一致。
9.3應(yīng)對儲存標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控(如溫濕度),保證儲存環(huán)境條件的符合性及持續(xù)性。
10標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的管理
10.1動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備完成后應(yīng)對其實施合理有效地管理。
10.2應(yīng)對在儲存期內(nèi)的動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢查,應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在整個儲存期間的狀況進(jìn)行定
期評估。當(dāng)發(fā)生動物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過期、變質(zhì)、包裝破裂、標(biāo)簽破損等情況時,應(yīng)及時將其從存放
處撤除,并用合適的方式處理,以免誤用。
10.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外部評價程序,以確保所生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量。評價至少包括證
書規(guī)范評價和其特性值評價。證書規(guī)范性評價應(yīng)按照GB/T15000.4、GB/T15000.7和我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管
理辦法進(jìn)行。特性值的評價應(yīng)包括測量值、穩(wěn)定性及均勻性。以上評價獨立測量數(shù)目應(yīng)不少于6個。
12
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附錄A
(資料性)
A.1病原體滅活標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備
A.1.1工藝流程(見圖A.1)
圖A.1病原體滅活標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖
A.1.2病原體的選擇、鑒定和增殖
根據(jù)本文件6.2條所規(guī)定的原則選取病原體,采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)、生化鑒定和特
異性基因片段的PCR或?qū)崟r熒光PCR檢測,結(jié)果符合預(yù)期的病原體使用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行增殖。
A.1.3樣品的制備及滅活
選取適當(dāng)?shù)慕臃N比例,將病原體接種到培養(yǎng)基(細(xì)菌)或細(xì)胞培養(yǎng)液(病毒)中,在標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定
的條件下培養(yǎng)并收集純化增值后的病原體。根據(jù)病原體特性選取適宜的物理或化學(xué)方法進(jìn)行滅活,滅活
后離心取上清,并采用適當(dāng)?shù)姆椒▽缁钚ЧM(jìn)行評價。
A.1.4初步定值、分裝和保存
提取滅活病原體DNA或RNA,并使用已知拷貝數(shù)的外標(biāo)品,通過實時定量外標(biāo)法經(jīng)線性回歸分析,獲
得滅活病原體DNA或RNA的拷貝數(shù)。根據(jù)定值結(jié)果,用核酸保存液將滅活病原體離心取上清的產(chǎn)物稀釋至
8
10Copies/μL,充分混勻后分裝入凍存管中,加貼唯一性標(biāo)識后,置-80℃保存。
A.2病原體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備
A.2.1工藝流程(見圖A.2)
13
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圖A.2病原體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖
A.2.2病原體的選擇、鑒定和增殖
同A.1.2。
A.2.3病原體DNA的提取和純化
病原體DNA選用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行,DNA提取物溶解在pH8.0的TE緩沖液中,并在-20℃下保存?zhèn)溆?。?/p>
于制備病原體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DNA相對分子質(zhì)量應(yīng)盡可能大,因此核酸提取過程中操作盡可能溫和,提取
過程盡量在低溫下進(jìn)行。另外,制備的病原體DNA必須是高純度的,沒有蛋白質(zhì)和RNA污染,各種離子濃
度也應(yīng)符合要求,提取過程中使用的玻璃器皿、試劑、離心管等一次性用品都應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格滅菌消毒。
A.2.4核酸純度的檢測
采用分光光度計法測試DNA在260nm和280nm下的吸光度,以O(shè)D260/OD280的比值來判斷提取的DNA純
度。如果OD260/OD280在1.7~2.0之間,表明所提取的DNA較純;當(dāng)OD260/OD280<1.7時,說明所提取的DNA有
蛋白質(zhì)污染;OD260/OD280>2.0時,說明提取的DNA有RNA污染。在提取的DNA不純時,應(yīng)重新提取。
A.2.5初步定值、分裝和保存
使用已知拷貝數(shù)的外標(biāo)品,通過實時定量外標(biāo)法經(jīng)線性回歸分析,獲得滅活病原體DNA的拷貝數(shù)。
8
根據(jù)定值結(jié)果,用核酸保存液將滅活病原體離心取上清的產(chǎn)物稀釋至10Copies/μL,充分混勻后分裝入
凍存管中,加貼唯一性標(biāo)識后,置-80℃保存。
A.3病原體質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備
A.3.1工藝流程(見圖A.3)
14
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圖A.3病原體質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖
A.3.2病原體的選擇、鑒定和增殖
同A.1.2。
A.3.3質(zhì)粒的構(gòu)建
將病原體滅活后,進(jìn)行基因擴(kuò)增。應(yīng)選擇具有檢測或分型意義的基因片段,選擇的基因片段應(yīng)足夠
長,應(yīng)涵蓋一般檢測方法和試劑的檢測范圍。獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接到載體上,然后轉(zhuǎn)化大腸
桿菌感受態(tài)細(xì)胞。PCR驗證挑選陽性克隆,對插入片段進(jìn)行測序確認(rèn),確保序列無突變,與已知序列完
全一致。
A.3.4質(zhì)粒DNA純度檢測及初步定值
將測序正確的陽性克隆菌落大量培養(yǎng),采用標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒DNA,采用紫外分光光度計法測試DNA
在260nm和280nm下的吸光度,以O(shè)D260/OD280的比值來判斷提取的質(zhì)粒DNA純度。如果OD260/OD280在1.8~2.0
之間,表明所提取的DNA較純;當(dāng)OD260/OD280<1.8時,說明所提取的DNA有蛋白質(zhì)污染;OD260/OD280>2.0時,
說明提取的DNA有RNA污染。若提取的DNA不純,應(yīng)重新提取。
質(zhì)粒DNA濃度按照公式(A.1)計算,并根據(jù)質(zhì)粒DNA分子量,按照公式(A.2)換算為Copies/μL。
DNA濃度(μg/mL)=OD260nm×50μg/mL×稀釋倍數(shù)(A.1)
-114
DNA濃度(Copies/μL)=OD260nm×50×M.W.×6.02×10×稀釋倍數(shù)(A.2)
A.3.5稀釋、分裝和保存
8
根據(jù)初步定值結(jié)果,用核酸保存液將制備好的質(zhì)粒DNA稀釋至10Copies/μL,充分混勻后分裝入凍存
管中,加貼唯一性標(biāo)識后,置-80℃保存。
15
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A.4病原體體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備
A.4.1工藝流程(見圖A.4)
圖A.4病原體RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖
A.4.2病原體的選擇、鑒定和增殖
同A.1.2。
A.4.3質(zhì)粒的構(gòu)建
同A.3.3。
A.4.4病原體RNA的體外轉(zhuǎn)錄
將純化后的質(zhì)粒用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行酶切。T7(或SP6)啟動子與插入片段以及插入片段中
間不應(yīng)有此限制性內(nèi)切酶作用的酶切位點,而且酶切后的末端不形成5’懸掛。獲得的線性化片段進(jìn)行體
外轉(zhuǎn)錄,對獲得的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化。使用脫氧核糖核酸酶DNase除去其中的DNA模板,使用TRIZOL
再次抽提RNA,即得到體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA母液。
A.4.5體外轉(zhuǎn)錄RNA純度檢測及初步定值
采用紫外分光光度計法測試RNA在260nm和280nm下的吸光度,以O(shè)D260/OD280的比值來判斷體外轉(zhuǎn)錄
RNA純度。要求OD260/OD280在1.9~2.1之間。RNA濃度按照公式(A.3)計算,并根據(jù)RNA分子量,按照
公式(A.4)換算為Copies/μL。
RNA濃度(μg/mL)=OD260nm×40μg/mL×稀釋倍數(shù)(A.3)
RNA濃度(Copies/μL)=OD260nm×40×M.W.-1×6.02×1014×稀釋倍數(shù)(A.4)
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