植物工廠化育苗教學(xué)課件 5離體快繁的操作步驟和程序

離體快繁的操作步驟和程序——植物工廠化育苗離體快繁成苗到室外植物的操作程序（1）無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立----啟動(dòng)培養(yǎng)-初代培養(yǎng)（2）不定芽的增殖培養(yǎng)---繼代接種及繼代培養(yǎng)（3）不定根的誘導(dǎo)-生根培養(yǎng)（4）試管苗馴化移栽初代培養(yǎng)無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立----啟動(dòng)培養(yǎng)（1）無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立—

啟動(dòng)培養(yǎng)—初代培養(yǎng)階段從外植體選擇、清洗、滅菌、接種和莖芽誘導(dǎo)，到獲得莖芽穩(wěn)定生長(zhǎng)和增殖，莖芽繁殖數(shù)量可控制的整個(gè)時(shí)期外植體：

植物組織培養(yǎng)的起始材料。從自然界環(huán)境狀態(tài)中，植物體上切取下來(lái)的器官，組織等。首次用于組培過(guò)程的植物材料，是組培工作的第一步。

對(duì)于外植體接種到培養(yǎng)基中之后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)室進(jìn)行最初階段的組培培養(yǎng)—

初代培養(yǎng)過(guò)程。

目標(biāo)：獲得穩(wěn)定的無(wú)菌無(wú)性培養(yǎng)材料，誘導(dǎo)芽發(fā)生，提供合適試管苗環(huán)境使培養(yǎng)物生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定。

無(wú)菌苗：無(wú)菌條件下，用于試管內(nèi)繼代增殖的植物材料稱完無(wú)菌母株或繁殖母株。得到無(wú)菌苗工作任務(wù)：外植體的滅菌在一定濃度的滅菌劑藥品中浸泡滅菌，藥劑滅菌的好壞關(guān)系成功率。注意：植物材料（老幼程度）、滅菌劑類型、濃度、滅菌時(shí)間四者統(tǒng)一考慮。不同藥品分別做兩次滅菌。每次時(shí)間比正常一次藥品滅菌浸泡時(shí)間短。（2）不定芽增殖培養(yǎng)–繼代培養(yǎng)

中間繁殖體：

通過(guò)初代培養(yǎng)所獲得的不定芽、莖段、胚狀體或原球莖等無(wú)菌材料叫中間繁殖體系繼代培養(yǎng)：繼代接種：對(duì)于中間繁殖體進(jìn)行切割分離并接種轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基叫繼代接種繼代培養(yǎng)：初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過(guò)程（增殖培養(yǎng)）繼代目的：擴(kuò)繁中間繁殖體系的數(shù)量，最后能達(dá)到邊繁邊生根的目的。

促進(jìn)培養(yǎng)物分化培養(yǎng)，反復(fù)繼代增殖，達(dá)到需要的數(shù)量。

芽增殖速度快，慢，多少的的關(guān)鍵是培養(yǎng)基（適宜外源激素種類和濃度配比及其重要）

細(xì)胞分裂素影響繁殖系數(shù)和不定芽的質(zhì)量。

①切割莖段：

針對(duì)有伸長(zhǎng)的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物進(jìn)行切割（至少保證一個(gè)節(jié)間帶一個(gè)芽，節(jié)間短可以2，3節(jié)切割為一段）

能保持母種特性，簡(jiǎn)便易行繼代苗如何切割進(jìn)行繼代接種？②分離芽叢：

適于由愈傷組織生出的芽叢

先切成芽叢小塊，接到分化培養(yǎng)基中，待稍大時(shí)再繼續(xù)培養(yǎng)。③分離原球莖等

切割成小塊

，轉(zhuǎn)移到新鮮增殖培養(yǎng)基。

蘭花最初每個(gè)莖尖或側(cè)芽大約2個(gè)月左右產(chǎn)生3-5個(gè)原球莖，然后每個(gè)再切成4-6塊，每一塊在1個(gè)月內(nèi)可產(chǎn)生3-5個(gè)原球莖。

1960年Morel發(fā)現(xiàn)把蘭花莖進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，它們不是長(zhǎng)成帶葉的苗，而是形成一個(gè)扁形球狀物，其基部生有假根，在形態(tài)上與種子萌發(fā)時(shí)由胚形成的原球莖相似，這種扁形球狀物后來(lái)也稱為原球莖。如何提高繼代苗繁殖速度：培養(yǎng)基：培養(yǎng)基種類、無(wú)機(jī)有機(jī)成分、糖濃度、瓊脂、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類濃度。（生長(zhǎng)素比例大，不定芽生長(zhǎng)健壯；細(xì)胞分裂素高，繁殖系數(shù)高芽分化率高，但組培苗弱，綜合權(quán)衡）-莖節(jié)過(guò)弱的情況可以進(jìn)行壯苗即降低細(xì)胞分裂素，加強(qiáng)生長(zhǎng)素濃度。培養(yǎng)條件：溫度、光照、濕度、培養(yǎng)器皿、通氣狀況、PH值都與增殖有關(guān)。盡量滿足培養(yǎng)物的需要，使其以最快速度生長(zhǎng)。高溫光照合適濕度。培養(yǎng)物保存：暫時(shí)不需要育苗或珍貴資源需要保存采用較低的溫度低溫1-9°c

短期保存------可以使繁殖速度降下來(lái)，不用經(jīng)常進(jìn)行接種更換培養(yǎng)基。

注意問(wèn)題

芽增殖過(guò)程中，注意外源激素在組培苗體內(nèi)的積累---空白培養(yǎng)基培養(yǎng)。長(zhǎng)期繼代增殖，外源激素大量積累會(huì)造成各種畸形芽莖，或玻璃化苗。影響不定芽質(zhì)量。繼代培養(yǎng)中需要酌情降低外援激素水平。各階段接種所基于的植物材料初代接種基于---外植體材料（外界采集經(jīng)過(guò)預(yù)處理劑滅菌）繼代培養(yǎng)材料基于—已經(jīng)啟動(dòng)脫分化，并啟動(dòng)分化模式，從外植體上形成芽及莖段的植株---中間繁殖體（培養(yǎng)室）生根培養(yǎng)材料基于--已經(jīng)擴(kuò)繁達(dá)到生產(chǎn)要求數(shù)量后的繼代無(wú)根芽苗進(jìn)行生根培養(yǎng)初代組培苗：一個(gè)莖段帶有一個(gè)腋芽大概1厘米高左右已進(jìn)行啟動(dòng)狀態(tài)的外植體，會(huì)出現(xiàn)再分化形成了新芽。或者切口脫分化形成愈傷組織繼代苗：芽多側(cè)枝多，一定高度的大量無(wú)根芽苗叢苗狀態(tài)生根階段生根組培苗，明顯的根，一般以單顆苗形式進(jìn)行組培并誘導(dǎo)生根區(qū)分各階段組培狀態(tài)為什么繼代組培苗無(wú)根？從繼代培養(yǎng)的目–增殖芽—芽，莖段—再增殖芽培養(yǎng)基中激素調(diào)節(jié)的方向，激素的作用

繼代苗能否持續(xù)繼代下去無(wú)限制的運(yùn)行下去，繼代培養(yǎng)次數(shù)過(guò)多易發(fā)生變異。應(yīng)該使部分培養(yǎng)物分流到壯苗生根階段。若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的試管苗發(fā)黃老化，或因過(guò)分擁擠而使無(wú)效苗增多，影響移栽成活率，而造成人、財(cái)、物的極大浪費(fèi)。

繼代培養(yǎng)組培苗瘦弱徒長(zhǎng)問(wèn)題現(xiàn)象：繼代培養(yǎng)組培苗在不斷增殖的過(guò)程中出現(xiàn)芽苗瘦弱、徒長(zhǎng)、節(jié)間過(guò)長(zhǎng)等現(xiàn)象，這種苗即便生根培養(yǎng)，移栽成活，抵抗力也比較弱。原因：1.細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高。產(chǎn)生過(guò)多，密集的不定芽，不及時(shí)切割繼續(xù)繼代-------瘦弱苗。2.培養(yǎng)溫度過(guò)高。高溫利于組培苗的生長(zhǎng)，多數(shù)品種適宜的溫度是25℃左右，在過(guò)高的溫度條件下，苗木的伸長(zhǎng)速度快。有節(jié)間的品種如香石竹、滿天星、菊花等，組培苗-----瘦弱。無(wú)節(jié)間種類如非洲菊、勿忘我、情人草主要是葉片變薄、變長(zhǎng)。3.光照時(shí)長(zhǎng)不足組培苗會(huì)變黃、變?nèi)?、變?xì)并加速生長(zhǎng)，使苗在短時(shí)間內(nèi)變得更瘦弱。解決辦法1、根據(jù)品種特點(diǎn)減少細(xì)胞分裂素用量，加速繼代轉(zhuǎn)瓶的速度，適當(dāng)降低接種密度。2、利用空調(diào)降低培養(yǎng)室溫度。3、提高光照強(qiáng)度和延長(zhǎng)光照時(shí)間，充分利用較強(qiáng)的自然光做光源，調(diào)整擺放位置和密度。4、調(diào)整培養(yǎng)基硬度，改用透氣膜做封口，進(jìn)行培養(yǎng)基及環(huán)境因子的綜合調(diào)控，力求獲得最優(yōu)質(zhì)健壯的組培瓶苗。

了解植物組織培養(yǎng)苗生根的目的和意義。了解影響生根的因素。掌握培養(yǎng)壯苗的方法。掌握植物組織培養(yǎng)苗的生根培養(yǎng)的基本方法步驟。生根培養(yǎng)基配制的原則和注意事項(xiàng)生根培養(yǎng)試管苗的生根培養(yǎng)：使無(wú)根芽苗生根從而形成完整植株的過(guò)程。

只達(dá)到生根就可以了嗎？生根培養(yǎng)目的是組培苗生根，

而生根目的在于組培苗具有完整植物器官后，能夠從組培瓶的生長(zhǎng)環(huán)境順利轉(zhuǎn)栽到自然環(huán)境狀態(tài)。適應(yīng)環(huán)境（足夠抵抗力抵抗自然界雜菌；適應(yīng)各種逆境，如溫度的變化，濕度變化（組培瓶?jī)?nèi)的環(huán)境是恒常的）生根培養(yǎng)的目的（1）為了中間繁殖體生出濃密而粗壯的不定根。（2）提高試管苗對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力，使試管苗能成功地移栽到試管外，獲得更多高質(zhì)量的商品苗。影響因素1.植物材料不同植物種類、不同的基因型、同一植株的不同部位和不同年齡對(duì)根的形成和分化具有重要作用。規(guī)律：木本植物較草本植物難，成年樹較幼年樹難，喬木較灌木難。扦插生根容易的植物，試管苗生根也容易；相反，扦插生根困難的植物，試管苗生根也難。例如：核桃樹、柿樹等扦插生根較困難，則試管苗也難以生根。有些試管苗由于在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，莖木質(zhì)化程度高，形成老苗，這類苗也很難生根。而生長(zhǎng)旺盛幼嫩的試管苗則容易誘導(dǎo)生根。一般誘導(dǎo)生根所需要的溫度比分化增殖的溫度低。

低溫，質(zhì)量好而且根的數(shù)量也比較適宜。低于15℃影響根的分化和生長(zhǎng)。

在生根培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可以為生根創(chuàng)造一個(gè)暗的環(huán)境，而且還能吸附一些有毒物質(zhì)，使根不易褐變，有利于根的生長(zhǎng)。對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，光照并不抑制根原基的形成和根的正常生長(zhǎng)，因此誘導(dǎo)生根普遍在光照下進(jìn)行。如果不容易生根的植物嘗試暗培養(yǎng)。培養(yǎng)基中豐富營(yíng)養(yǎng)使試管苗產(chǎn)生依賴性而不容易生根

。減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的含量可以刺激生根。異養(yǎng)狀態(tài)------自養(yǎng)狀態(tài)

MS、B5等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，但是其含鹽濃度要適當(dāng)降低，都富含N、P、K鹽，均抑制根的生長(zhǎng)。應(yīng)將它們分別降低到1/2、1/3和1/4如：無(wú)籽西瓜在1/2MS時(shí)生根較好；硬毛獼猴桃在1/3MS時(shí)生根較好；月季的莖段在1/4MS時(shí)生根較好；水仙的小鱗莖則在1/2MS時(shí)才能生根。鈣、微量元素中的硼和鐵，維生素維生素B6、維生素Bl均有利于生根；肌醇對(duì)生根作用不大，有時(shí)甚至起抑制作用。繼代培養(yǎng)MS+BA2+IBA0.2生根培養(yǎng)1/2ms+IBA1

糖的濃度對(duì)試管苗生根影響低濃度糖有利于試管苗的生活方式由異養(yǎng)向自養(yǎng)轉(zhuǎn)變，提高生根苗的移栽成活率。生根培養(yǎng)基中糖的含量要比繼代培養(yǎng)基中減少一半或更多。繼代培養(yǎng)試管嫩莖（芽苗）一般隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，其生根能力有所提高。如：蘋果試管嫩莖繼代培養(yǎng)的次數(shù)越多則生根率越高，富士蘋果在前6代之內(nèi)生根率低于30％，生根苗的平均根數(shù)不足2條，繼代次數(shù)的增加，到第10代時(shí)生根率達(dá)80％，12代以后則生根率達(dá)到95％以上；杜鵑莖尖培養(yǎng)中，隨培養(yǎng)次數(shù)的增加，小插條生根數(shù)量明顯增加，第四代最高，最后達(dá)100％的生根。生長(zhǎng)素類藥品促進(jìn)生根NAA>IBA>IAA，2，D用愈傷組織誘導(dǎo)

IBA作用強(qiáng)烈，作用時(shí)間長(zhǎng)，誘導(dǎo)的根多而長(zhǎng)，適用于木本植物IAA誘導(dǎo)出的根比較細(xì)長(zhǎng)，適用于草本植物

難生根的IBA與IAA交替使用兩種生長(zhǎng)素，效果可能會(huì)好些。NAA誘導(dǎo)出的根比較短粗。IBA、NAA0.1、1.0mg/L有利于生根，兩者可混合使用，高濃度生長(zhǎng)素促使根向短粗方向發(fā)展，但超過(guò)一定限度，則加速形成愈傷組織，影響根的形成與生長(zhǎng)。

細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素對(duì)生長(zhǎng)素有拮抗作用，從而對(duì)根的生長(zhǎng)具有抑制作用，生根培養(yǎng)基中一般不加細(xì)胞分裂素。壯苗長(zhǎng)期多次的繼代培養(yǎng)，高濃度的細(xì)胞分裂素使芽分化速度加快芽小而密，生長(zhǎng)極其緩慢。

芽在轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基前，首先要轉(zhuǎn)到細(xì)胞分裂素偏低或沒(méi)有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1、3代，待芽苗長(zhǎng)得粗壯時(shí)，再轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，這樣提高了苗的質(zhì)量。生根培養(yǎng)基配制原則（1）降低繼代培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度。一般MS大量母液減半或1／4；（無(wú)機(jī)鹽，尤其硝態(tài)鹽，銨態(tài)鹽抑制根分化）（2）去掉原培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素成份；（3）降低蔗糖濃度（如減半）（減少碳源，減少養(yǎng)分加強(qiáng)自養(yǎng)，培養(yǎng)根發(fā)生）（4）適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素；（4）適當(dāng)增加瓊脂濃度；（5）對(duì)有些植物可適當(dāng)加些吸附劑（如活性炭），有促進(jìn)生根的作用。

生根培養(yǎng)的方法新梢達(dá)到3cm以上時(shí)切除基部愈傷組織，分株成單棵的形式：1、將新梢基部浸入50mg/L或100mg/LIBA溶液中處理4-8h，誘導(dǎo)根原基的形成，再轉(zhuǎn)移至無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上促進(jìn)幼根的生長(zhǎng)。2、在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6d，待有根原基形成后，再進(jìn)一步培養(yǎng)3、直接移入含有生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中。

上述三種方法均能誘導(dǎo)出新根，但前兩種方法對(duì)新根的生長(zhǎng)發(fā)育更為有利，而第三種方法對(duì)幼根的生長(zhǎng)有抑制作用，其原因是當(dāng)根原基形成后，較高濃度生長(zhǎng)素的繼續(xù)存在不利于幼根的生長(zhǎng)發(fā)育。轉(zhuǎn)接方法

芽叢縱向切成單株，高度在1cm長(zhǎng)以上的芽苗可進(jìn)行生根培養(yǎng)（不足1cm的芽苗及愈傷組織用于繼代培養(yǎng)）。單顆植株、繼代方式切割

。

將分離得到的單株植物的基部愈傷組織切掉（如果留下，根將在愈傷組織里增殖），然后按形態(tài)上下極插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。生根苗可以較密集的插在培養(yǎng)基中，每瓶可插10株以上。少數(shù)難生根植物（1）濾紙橋培養(yǎng)（液體）：

采用粗試管加液體培養(yǎng)基，并在試管中放置濾紙做的筒狀物（濾紙橋），托住切成單條的嫩枝，濾紙橋略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)嫩枝的水、營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)素等，解決生根時(shí)氧氣不足的問(wèn)題，從而誘導(dǎo)出新根，可使生根過(guò)程加速，如山茶花、香石竹等花卉試管苗的生根培養(yǎng)。（2）分次培養(yǎng)：

對(duì)于少數(shù)因?yàn)槎啻卫^代殘留過(guò)多的細(xì)胞分裂素而難以生根的植物，可先在不含任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中過(guò)渡培養(yǎng)一次，再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根的進(jìn)一步培養(yǎng)。

對(duì)于一些生長(zhǎng)細(xì)弱的植物，采用不加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行一次壯苗培養(yǎng)，可適當(dāng)加入少許矮壯素，以促使幼苗粗壯，便于誘導(dǎo)生根和以后的種植。

由胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先即己分化的根，可以不經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)生根階段。但由于經(jīng)過(guò)胚狀體發(fā)育的苗數(shù)比較多，且個(gè)體較小，所以常需要低濃度或沒(méi)有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。試管外生根所謂試管外生根，就是將植物組織培養(yǎng)中莖芽的生根誘導(dǎo)階段同培養(yǎng)階段結(jié)合在一起，直接將莖芽扦插到試管外的有菌環(huán)境中，省去了用來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并起支持作用的培養(yǎng)基，簡(jiǎn)化了植物組織培養(yǎng)程序，降低了成本，提高了繁殖系數(shù)。適合范圍1、容易生根的試管苗，如菊花、楊樹，櫻桃、康乃馨、月季、無(wú)籽西瓜等，可以不經(jīng)過(guò)瓶?jī)?nèi)生根而直接從試管中取出進(jìn)行瓶外生根。2、試管內(nèi)生根質(zhì)量差，根和莖之間的維管束連接不好，或者沒(méi)有須根和根毛，直接影響移栽成活率。3、很多植物可以把試管繁殖的嫩枝當(dāng)做微型插條，直接插入基質(zhì)中生根成活，如將楊樹、樺木和其他闊葉樹試管繁殖的嫩梢，直接栽入泥炭和蛭石基質(zhì)中，可很快生根，且成活率較高。試管外生根的優(yōu)點(diǎn)瓶外生根苗避免了根系附著的瓊脂造成的污染腐爛。根系發(fā)育正常健壯，根與莖芽的輸導(dǎo)系統(tǒng)相通，吸收功能較強(qiáng)，并且試管苗瓶外生根在生根過(guò)程中即己逐步適應(yīng)了環(huán)境，經(jīng)受了自然環(huán)境的鍛煉，不適應(yīng)環(huán)境的弱苗在生根過(guò)程中己經(jīng)被淘汰，移栽苗都是抗逆性強(qiáng)的壯苗，容易成活。瓶外生根方法（1）誘導(dǎo)出根源基后再扦插

將繼代叢生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可插的密些，培養(yǎng)十天左右可見嫩莖基部明顯產(chǎn)生根源基時(shí)取出，移栽到事先準(zhǔn)備好的穴盤里進(jìn)行培養(yǎng)。瓶外生根方法（2）生長(zhǎng)素處理法

將無(wú)根的試管苗取出后，用生長(zhǎng)素溶液浸泡一小時(shí)或蘸生根粉后進(jìn)行扦插。用生長(zhǎng)素濃度一般比誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基大10倍左右。