DB37T 3673-2019 牡蠣皰疹病毒1型檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 巢式PCR法

DB37DB37/T3673—2019牡蠣皰疹病毒?型檢測(cè)技術(shù)規(guī)范巢式PCR法Ostreidherpesvirus-1DetectionSpecification-NestedPCR2019-08-30發(fā)布2019-09-30實(shí)施山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 1 1 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 71本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牡蠣皰疹病毒?型（Ostreidherpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR檢測(cè)方法，適用于牡蠣皰疹病毒?型屬于軟體動(dòng)物皰疹病毒科（Malacoherpesviridae）、牡蠣皰疹病毒屬dNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetTris：三羥甲基氨基甲烷（trishydroxym24.1.7Tirs飽和酚（pH≥7.8分4.1.94.1.9氯仿/異戊醇(24:1)：4.1.18外引物CR：5’-CCACA）：3（＞樣品采集后分別置于1.5mL離心管中，立即進(jìn)行DNA提取6.1.4水相移至新1.5mL離心管中，加入等體積酚/4TaqDNA聚合酶為本批檢測(cè)結(jié)果可靠（如圖1所示）。陽(yáng)性對(duì)照未在657bp處出現(xiàn)條帶，或陰性對(duì)照在657bp處出現(xiàn)條序列（參見附錄B）進(jìn)行比較，若序列符合可判斷待測(cè)樣品為牡蠣皰疹病毒?型PCR陽(yáng)性；當(dāng)檢測(cè)樣本無5加水定容至100mL，經(jīng)0.45m濾膜6去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加入KCl74.55mg，加入MgCl22.86mg，充分?jǐn)嚢枞芙?，在電泳區(qū)用1×TAE電泳緩沖液配制1.2%的瓊脂糖凝膠，建議于三角燒瓶中配制，在電爐上或微波爐中加熱至溶液完全透明(為避免煮沸時(shí)液體外溢，膠液體積應(yīng)少于容器體積的1/4)。待溶液冷卻至將凝膠液緩緩倒入設(shè)置好樣孔梳和防漏條/套的水平放置的凝膠船，膠液厚度0.6cm～0.8cm。樣向離心管中6ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤?ml甘油混勻，最終用去離子水定容至10ml，室溫保Attacccagattcccctcgaggtagcttttgtcaagatgaaacaaaatattatgcaacgaggaaattatacgtcaacatcactgtgaatacaacggagatttgacaaggtgttctataccatacgacctacacaaacctgtttttgaaaaccaaatgtgtgttatcccaatgcactctttaccatgaagatacccaccaatgtggtaaagacggaacaatgcggcgctatggatttaacgagtgccaccaaaagttgggataatgattttagaatagatgtgatgtgcggcaagacacaatgagctattacccgaccacaaacctaacgttgtattcgattacggattaagaaaatgggttccacaatccacatgggggccaaggaatttaaagccccggggaaaaaagtataaataggcgcgatttgtcagtttagacgagtataccacaactgctaaattaacagcatctactactactactgaaaaatgcagcctttcacagaattttgcatcacatcagccagcaacgactttttcatcaaccagacgaggttaacatgcgacatttgtaaagagataaagtcgtggcatcattggctgcagtcagatctgacatacccatagaagtcacggaacgcaaagaccagttcttcgaaaagaagatagagtttaccactctcattgacgaattgttcactgcccacaaagaccagtgcaccatgctcagcatcattgccggtagatacaccaatgaactttaccgcgaagagtccatagaggagaggcatacaaattggacctgatcaatcaacagttctttaggaataacaggttatacgacatcctgaaagaggccgagaggatcatgttagaagatgaaattgaatctgtttgcaagaccaaggccaaatctcccga