DB21T 3848-2023 中華小長(zhǎng)臂蝦種質(zhì)鑒定規(guī)范　　

ICS67.120.30CCSB50DB21SpeciesidentificationofPalaemonetessinensis遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB21/T3848—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：李應(yīng)東、趙瑩瑩、李曉東、魏華、胡清彪、姜宏波、邢躍楠、包杰、豐程程、于業(yè)輝。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太北原街2號(hào)聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)（沈陽(yáng)市沈河區(qū)東陵路120號(hào)），聯(lián)系電話：024-884871461DB21/T3848—2023中華小長(zhǎng)臂蝦種質(zhì)鑒定規(guī)范本文件規(guī)定了中華小長(zhǎng)臂蝦（Palaemonetessinensis）的學(xué)名與分類、生物學(xué)特征、生長(zhǎng)與繁殖、遺傳學(xué)特性、檢測(cè)方法與檢驗(yàn)判定規(guī)則。本文件適用于中華小長(zhǎng)臂蝦的種質(zhì)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18654.1養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第1部分：檢驗(yàn)規(guī)則GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法GB/T18654.4養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第4部分：年齡與生長(zhǎng)的測(cè)定GB/T18654.6養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第6部分：繁殖性能的測(cè)定GB/T18654.12養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第12部分染色體組型分析GB/T18654.14養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第14部分DNA含量的測(cè)定SC/T1102-2008蝦類性狀測(cè)定3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4學(xué)名與分類4.1學(xué)名中華小長(zhǎng)臂蝦（Palaemonetessinensis）4.2分類地位屬甲殼綱（Crustacea）十足目（Deoapoda）長(zhǎng)臂蝦科（Palaemoni5主要生物學(xué)性狀5.1外部形態(tài)體透明，呈青色略帶微黃色。額劍短于頭胸甲，平直前伸，上具5齒～6齒。頭胸甲具觸角刺、鰓甲刺、無(wú)肝刺、鰓甲溝伸至頭胸甲中部之前。尾節(jié)末端呈尖刺狀，兩側(cè)各具1大1小兩刺。大顎不具觸須。體長(zhǎng)25mm～50mm。卵大，卵徑為1.18mm～1.50mm×1.00mm～1.04mm，卵呈棕綠色。自頭胸甲兩側(cè)至第6腹節(jié)均有棕色或棕黑色的條紋，以第3腹節(jié)色最濃。雌雄異體，雌性生殖系統(tǒng)包括卵巢、輸卵管；雄性生殖系統(tǒng)包括1對(duì)精囊、輸精管和精莢囊。中華小長(zhǎng)臂蝦外形見圖1。2額劍齒式：上額角齒數(shù)/下額角齒數(shù)為5～6/1～2。長(zhǎng)的范圍：0.612～0.972。產(chǎn)卵期為4月中旬至7月中旬，沉性兼粘性3體細(xì)胞染色體二倍數(shù)，2n=88。7.1.2核型染色體核型公式為2n=88=66m+10sm+4st+8t。中部著絲粒染色體(m組)33對(duì)；亞中部著絲粒染色體(sm組)5對(duì)；亞端部著絲粒染色體(st組)2對(duì)；端部著絲粒染色體(t組)4對(duì)；染色體(NXKX人AA7.2.1中華小長(zhǎng)臂蝦線粒體16srRNA基因標(biāo)記CCGGTCTGAACTCAGATCACGT,獲得長(zhǎng)度為523bp,群體內(nèi)個(gè)體間遺傳距離小于2%,序列如下：5'-tatgagctattaatataaagtctagcctgcccactgagtaattaaagggctgcagtaattgataatcagtagtctttaattgaaggcttgaatgaatggctggatgagggagaaactgtcttttggtaaattaaaagtgaaaaggcttaaatttattaaggggacgataagaccctataaaacttaatatttattatatttgtttttacaaagttagtatatattttgttggggagacattgacataattaataactgtctaatttaaatgtttatagctaatccttcttgaaggataaaaagagcaagttacttagggataacagcgtaatttctgagagttcttatcgacctcgatgttgaattaaaattctgttaggtgtagccgtttaacaagtaggtctgttcgacctttaaa對(duì)線粒體COI基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，PCR引物序列為群體內(nèi)個(gè)體間遺傳距離小于2%,序列如下：5'-atattggcccactatactttgtatttggagcttgagcaggaatagtaggaacttcttaagactattggacaaccaggcaccttaatcggaaatgatcaaattacaatgtggttgtaacggcacacgctttcgttataataataccaattataattggtggatttggaaattgacttgtacccctaatgctaggagctcctgatatagcattccacataagatttgactcctccccccttctttaacactcattcttctagaggtatagtagaaagaggagtcgtttaccctcccctagcgagagggttaggccacgctggagcttcggtagacctgggtattttctcttacatttctattgggtgctgtaaatttcattacaactgtaattaatatacgagctccgggaataactatggaccgaactgagcagtttaactgctattttattactactttctctacctattttagcaggggctattactatgctttaacagaccgaaatctaaatacttctttctttgaccctgctggagggggggatcctattctttatcaacattt8檢測(cè)方法4DB21/T3848—20238.1抽樣方法按GB/T18654.2執(zhí)行。8.2性狀檢測(cè)按SC/T1102-2008執(zhí)行。8.3年齡與生長(zhǎng)測(cè)定按GB/T18654.4執(zhí)行。8.4繁殖性能測(cè)定按GB/T18654.6執(zhí)行。8.5染色體檢測(cè)按GB/T18654.12的規(guī)定執(zhí)行。8.6DNA含量測(cè)定按GB/T18654.14執(zhí)行。8.7分子遺傳學(xué)標(biāo)記方法8.7.1DNA的提取取尾部肌肉，剪碎組織，加200μL裂解液（EDTA(pH8.0)：200mmol/L；SDS：1ProteinaseK：200μg/mL）50℃溫育3h～4h；加入等體積飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比25：24：1）400μL抽提，8000r/min，離心20min后，取上清液，再重復(fù)抽提2次；在上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀20℃靜置；12500r/min，離心20min，用70％乙醇洗沉淀2次，晾干，加入50μL的1×TE（pH8.0）溶解。使用DNA定量?jī)x測(cè)定樣品DNA的純度和濃度。-20℃保存?zhèn)溆谩?.7.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)8.7.2.1擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15μL，其中包括摸板DNA50ng、10×buffer1.5μL，Mg2+(25mmol?L-1)1.5μL、dNTPS（10mmol?L-1)各0.25μL、Taq酶1U、上下游引物(10μmol?L-1)各0.15μL（16SrRNA，COI和微衛(wèi)星DNA法分別使用各自的引物）。8.7.2.2線粒體16SrRNA基因法反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。8.7.2.3線粒體COI基因法反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。8.7.2.4擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物與1μL上樣緩沖液混合點(diǎn)樣，1%瓊脂糖凝膠中電泳20min，電壓120v，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照記錄。PCR產(chǎn)物純化后雙向測(cè)序。8.7.3結(jié)果分析