病理檢驗(yàn)技術(shù)（第3版）課件 第11章 細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)

第十一章細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)1第十一章細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)

學(xué)習(xí)目標(biāo)1.了解細(xì)胞和組織化學(xué)方法的范圍和種類(lèi)、酶的種類(lèi)。2.熟悉細(xì)胞和組織化學(xué)方法的基本技術(shù)和注意事項(xiàng)、光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)的基本程序、酶組織化學(xué)技術(shù)的染色方法。3.掌握核酸的顯示技術(shù)和堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡糖-6-磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、非特異性酯酶、琥珀酸脫氫酶的顯示技術(shù)。2第一節(jié)細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)概述一、細(xì)胞和組織化學(xué)方法研究的范圍細(xì)胞和組織化學(xué)方法研究的內(nèi)容有狹義和廣義之分。狹義的細(xì)胞和組織化學(xué)方法只研究核酸和酶的顯示與檢測(cè)；而廣義的細(xì)胞和組織化學(xué)方法則顯示和檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的所有物質(zhì)。3第一節(jié)細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)概述二、細(xì)胞和組織化學(xué)方法的分類(lèi)（一）化學(xué)方法（二）類(lèi)化學(xué)方法（三）物理學(xué)方法（四）應(yīng)用物理化學(xué)特性的方法（五）應(yīng)用生物學(xué)特性的方法（六）顯微燒灰法4第一節(jié)細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)概述三、細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)的基本要求1.要保持組織細(xì)胞的生前結(jié)構(gòu)2.需保存細(xì)胞和組織中的化學(xué)成分以及酶的活性，以保證進(jìn)行定量研究3.所用的方法要有高度的特異性4.所用方法應(yīng)有一定的靈敏性5.實(shí)驗(yàn)要有可重復(fù)性5第一節(jié)細(xì)胞和組織化學(xué)技術(shù)概述四、細(xì)胞和組織化學(xué)方法注意事項(xiàng)1.組織材料切片和染色要及時(shí)。2.選擇的試劑必須是分析純（Ａ.Ｒ）,試劑的稱(chēng)量和配制要準(zhǔn)確，酶組織化學(xué)中試劑和作用液的PH更需精確測(cè)量。3.實(shí)驗(yàn)所用器皿要充分清洗以保持清潔。使用的蒸餾水應(yīng)為雙蒸水。4.嚴(yán)格控制好反應(yīng)物質(zhì)的濃度、反應(yīng)時(shí)的溫度、試劑的PH以及反應(yīng)時(shí)間，以保證良好的染色效果。5.必須做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，正確分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，注意識(shí)別假陰性和假陽(yáng)性。6一、Feulgen-Rossenbeck改良DNA顯示法

［染色原理］

切片先經(jīng)稀鹽酸處理，使細(xì)胞內(nèi)DNA水解，DNA分子中嘌呤堿基和脫氧戊糖之間結(jié)合斷開(kāi)，暴露出戊糖上的醛基，再用Schiff液處理，后者與醛基結(jié)合形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物，從而顯示出DNA。

［試劑配制］

［染色步驟］

第二節(jié)核酸（DNA、RNA）的顯示技術(shù)7一、Feulgen-Rossenbeck改良DNA顯示法

［結(jié)果］DNA被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)及其他成分呈淺綠色。

［對(duì)照實(shí)驗(yàn)］

用1mg/mLDNA酶，37℃，消化切片2H后再染色DNA及細(xì)胞質(zhì)均呈綠色。

［注意事項(xiàng)］

(1)Schiff試劑PH應(yīng)調(diào)整為4.0。

(2)鹽酸水解時(shí)，1mol/L鹽酸必須事先預(yù)熱至60℃，水解時(shí)間應(yīng)視固定液而定，水解不足或過(guò)長(zhǎng)均會(huì)影響染色效果。第二節(jié)核酸（DNA、RNA）的顯示技術(shù)8二、Cook甲基綠派洛寧法

［染色原理］

甲基綠和派洛寧在水中電離后均帶正電荷，前者堿性較強(qiáng)，帶兩個(gè)正電荷；后者堿性較弱，帶一個(gè)正電荷。當(dāng)染液PH為4.2時(shí)，DNA和RNA均帶負(fù)電荷，但電荷數(shù)量不同。染色時(shí)，堿性強(qiáng)的甲基綠與DNA結(jié)合而顯示為綠色，派洛寧則與RNA結(jié)合顯示為紅色。

［試劑配制］

［染色步驟］

第二節(jié)核酸（DNA、RNA）的顯示技術(shù)9二、Cook甲基綠派洛寧法

［結(jié)果］

DNA染成綠色，RNA染成紅色。漿細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色或淡紅色。

［注意事項(xiàng)］

（1）染色以后不能用水洗。

（2）丙酮分化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

（3）樣品若為骨組織，應(yīng)調(diào)整染液比例，增加甲基綠的含量而減少派洛寧的含量。

（4）染液PH必須控制在4.8左右，不可偏高或偏低。

第二節(jié)核酸（DNA、RNA）的顯示技術(shù)10第三節(jié)核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白的顯示技術(shù)一、AgNOR的石蠟切片經(jīng)典染色法［試劑配制］[染色方法][結(jié)果]用100×油鏡觀察細(xì)胞核和胞質(zhì)背景為淡黃色,AgNOR呈黑色顆粒狀或黑色細(xì)小點(diǎn)狀,分散于整個(gè)核仁之中。11第三節(jié)核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白的顯示技術(shù)二、AgNOR的石蠟切片李青改良染色濃(1993年)［試劑配制］[染色方法][結(jié)果]AgNOR呈黑色顆粒。12第三節(jié)核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白的顯示技術(shù)二、AgNOR的石蠟切片李青改良染色濃(1993年)［試劑配制］[染色方法][結(jié)果]AgNOR呈黑色顆粒。注意事項(xiàng)：(1)配制ARNOR染色液時(shí),對(duì)硝酸銀的質(zhì)量要求高,不能潮解。(2)明膠的質(zhì)量是影響非特異性銀顆粒的重要因素。(3)AgNOR染色過(guò)程中,需嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度。13第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)酶的概念：是生物體內(nèi)具有催化作用的特異性蛋白質(zhì),在組織細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程都有酶的催化作用。酶的催化作特點(diǎn)：具有高度的特異性,一種酶只能催化一種底物或一組有關(guān)物質(zhì),并在酶具有活性的時(shí)候才能發(fā)揮作用。14第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)一酶的種類(lèi)，按照其催化性質(zhì)分為六大類(lèi)。（一）氧化還原酶如乳酸脫氫酶、SDH等。（二）水解酶如ARP、ACP等。（三）轉(zhuǎn)換酶如Υ-GT等。（四）裂合酶如亮氨酸氨基肽酶、碳酸酐酶等。（五）異構(gòu)酶如葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶等。（六）合成酶如三磷酸胞苷合成酶。15第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)二酶的保存及影響酶活性的因素（一）酶的保存（二）影響酶活性的因素1.溫度大多數(shù)酶反應(yīng)的適宜溫度為37℃。2.pH酶的活性與反應(yīng)液的pH有密切的關(guān)系。3.抑制劑(1)特異性抑制劑；(2)非異性抑制劑；(3)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。4.激活劑16第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)三酶組織化學(xué)的原理顯示酶的組織化學(xué)反應(yīng)主要有以下幾種。（一）金屬離子沉淀反應(yīng)（二）偶氮鹽偶聯(lián)反應(yīng)（三）靛藍(lán)反應(yīng)（四）四唑反應(yīng)17第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)四酶組織化學(xué)技術(shù)的染色方法（一）蓋玻片染色缸法（二）滴加作用液法（三）漂浮法（四）環(huán)、框技術(shù)（五）半透膜技術(shù)18第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)五光鏡酶銀織化學(xué)技術(shù)的基本步驟1.石蠟切片脫蠟至水,冷凍切片固定后水洗。2.孵育液孵育。3.洗滌切片。4.金屬置換(金屬陽(yáng)離子沉淀法)。5.洗滌切片。6.顯色。7.洗滌、封固光鏡觀察。19第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)六、常用酶組織化學(xué)技術(shù)（一）堿性磷酸酶的顯示方法1.Gomori-Takamatsu鈣鈷法2.Gomori改良鈣鈷法3.Lojda改良Burstone偶聯(lián)偶氮法20第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)六、常用酶組織化學(xué)技術(shù)(二)酸性磷酸酶的顯示1.Hoht與Bitensky改良硝酸鉛法2.Leder-Stutt改良酚AS-TR磷酸脂法21第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)六、常用酶組織化學(xué)技術(shù)(三)葡糖-6-磷酸酶(G-6-P)的顯示l.Chiquoine硫化鉛法2.Wachstein-Meisel硝酸鉛法22第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)六、常用酶組織化學(xué)技術(shù)(四)Υ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的顯示原理：以Υ-L-谷氨酰-α-萘胺為底物,生成的萘胺與重氮鹽結(jié)合形成不溶的偶氮染料。[結(jié)果]酶活性處呈橘紅色，胞核呈藍(lán)色。23第四節(jié)光鏡酶組織化學(xué)技術(shù)六、常用酶組織化學(xué)