臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù) 課件 項(xiàng)目十一 新生兒溶血病實(shí)驗(yàn)室檢查

新生兒溶血病實(shí)驗(yàn)室檢查掌握：新生兒溶血病的定義、實(shí)驗(yàn)室檢查。熟悉：新生兒溶血病的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)。了解：新生兒溶血病的治療和預(yù)防。能做到新生兒溶血病實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目的正確選擇和初步判斷。學(xué)習(xí)目標(biāo)任務(wù)一新生兒溶血病狹義廣義各種病因使胎兒或新生兒紅細(xì)胞破壞增多的疾病，病因包括母嬰血型不合、紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、地中海貧血等.指母嬰血型不合引起的溶血病，臨床上以母嬰血型不合引起的最為常見。新生兒溶血病（HemolyticDiseaseoftheNewborn，HDN）抗體紅細(xì)胞新生兒溶血病——發(fā)病機(jī)制ABO系統(tǒng)HDN90%以上發(fā)生于O型母親孕育了A型、B型或AB型的胎兒ABO血型不合引起的HDN在Rh血型不合溶血病中以D抗原不合最為多見，臨床表現(xiàn)也最嚴(yán)重Rh血型不合的HDN由于胎兒從父體遺傳獲得母體缺乏的顯性抗原發(fā)病機(jī)制產(chǎn)道損傷胎兒紅細(xì)胞進(jìn)入母體產(chǎn)生的IgG抗體，抗原抗體結(jié)合細(xì)胞溶血ABO血型Rh血型通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)。新生兒溶血病——臨床表現(xiàn)臨床特點(diǎn)ABO血型不合HDNRh血型不合HDN發(fā)生頻率常見不常見發(fā)生的母子血型主要發(fā)生在母親O型，胎兒A型或B型母親缺少任一Rh抗原，胎兒具有該Rh抗原發(fā)生胎次第—胎可發(fā)病(約半數(shù))—般發(fā)生在第二胎，但第—胎亦可發(fā)病下一次情況不—定大多數(shù)更嚴(yán)重臨床表現(xiàn)較輕較重，嚴(yán)重者甚至死胎黃疸—般出生后2～3天出生24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)并且迅速加重貧血較輕嚴(yán)重貧血伴心力衰竭肝脾腫大少見多有不同程度的肝脾大晚期貧血少見可發(fā)生，持續(xù)至出生后3～6周HDN的胎兒紅細(xì)胞破壞增多，機(jī)體運(yùn)輸氧的能力下降，造成組織缺氧，引起一系列病變新生兒溶血病——臨床表現(xiàn)HDN除了新生兒黃疸出現(xiàn)早以外，血清膽紅素水平在短時(shí)間內(nèi)快速上升也是其特點(diǎn)黃疸HDN由于胎兒對(duì)紅細(xì)胞破壞增加的反應(yīng)是增加紅細(xì)胞生成速率，對(duì)紅細(xì)胞需求的增加可引起髓外造血，因此患兒常有肝脾大，Rh血型不合導(dǎo)致的HDN肝脾腫大更明顯。肝脾腫大病死率高，存活的患兒恢復(fù)后期可出現(xiàn)手足徐動(dòng)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙、聽覺障礙或牙釉質(zhì)發(fā)育不良等后遺癥。膽紅素腦病患兒出生后精神萎靡、嗜睡、少吃、少哭；有的出生后不久即發(fā)生心力衰竭。嚴(yán)重者可危及生命。貧血孕婦在妊娠期體重增加迅速，提示有胎盤水腫的可能性，胎盤和新生兒體重之比在1:7以下。水腫兒多會(huì)早產(chǎn)，少數(shù)足月娩出，在母體或出生后全身水腫，在胸腔、腹腔和心包腔內(nèi)出現(xiàn)積液，皮膚蒼白、肝脾腫大，呼吸困難，預(yù)后差，死亡率高。水腫新生兒溶血病——治療與預(yù)防(治療)治療目的：一是預(yù)防或緩解胎兒產(chǎn)生嚴(yán)重貧血、水腫，降低胎死宮內(nèi)幾率，從而緩解胎兒出生后的一些嚴(yán)重并發(fā)癥；二是預(yù)防或緩解新生兒因高膽紅素血癥引起的腦部損傷。光照療法藥物治療血液治療方法：讓患兒裸體睡于藍(lán)光箱中央，光源距嬰兒體表50cm，兩眼及外生殖器用黒罩或黑布遮蓋。箱周溫度應(yīng)保持在30-32℃，每小時(shí)測(cè)肛溫1次，使體溫保持在36.5-37.2℃之間?？蛇B續(xù)照射24-72小時(shí)。腎上腺皮質(zhì)激素：能阻止抗原與抗體反應(yīng)減少溶血，能促進(jìn)肝細(xì)胞葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)膽紅素的結(jié)合能力。酶誘劑：能誘導(dǎo)肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性，降低血清非結(jié)合膽紅素。其他：丙種球蛋白、白蛋白、中藥等。換血療法：ABO血型不合溶血癥選用O型懸浮紅細(xì)胞與AB型血漿混合后的血液。血液制品與血液制劑輸注：可輸注血漿或（和）白蛋白。新生兒溶血病——治療與預(yù)防(預(yù)防)預(yù)防方法胎兒期藥物預(yù)防、血漿置換、宮內(nèi)輸血、酶誘導(dǎo)劑、提前分娩、終止妊娠等出生后新生兒ABO溶血?。撼錾缙诒O(jiān)測(cè)膽紅素，達(dá)到光療標(biāo)準(zhǔn)時(shí)及時(shí)光療新生兒Rh血型不合溶血病：RhD抗原陰性婦女在娩出RhD陽(yáng)性新生兒后72小時(shí)內(nèi)，肌內(nèi)注射IgG抗D血清，再次妊娠29周時(shí)可再肌注1次效果更好，可避免抗體的產(chǎn)生。任務(wù)二新生兒溶血病的實(shí)驗(yàn)室檢查一、常規(guī)檢查表10-2夫妻ABO、Rh血型是否相合的判斷

血紅蛋白降低，一般<145g/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞常增多。外周血涂片可見有核紅細(xì)胞。白細(xì)胞計(jì)數(shù)可增高，血小板計(jì)數(shù)可正常。

膽紅素測(cè)定包括新生兒產(chǎn)前羊水及臍帶血檢測(cè)，羊水檢測(cè)可預(yù)測(cè)子宮內(nèi)的溶血情況，膽紅素濃度越高，溶血越重；新生兒臍血膽紅素測(cè)定，可診斷新生兒病理性黃疸及程度，是治療的依據(jù)。血常規(guī)檢查膽紅素測(cè)定新生兒溶血病的實(shí)驗(yàn)室檢查常規(guī)檢查產(chǎn)前血型血清學(xué)檢查——血型鑒定血型鑒定：血型鑒定包括夫妻雙方的ABO血型系統(tǒng)和Rh血型系統(tǒng)，以預(yù)測(cè)母嬰之間是否可能存在血型不合。條件允許可做胎兒羊水ABO血型物質(zhì)檢查，進(jìn)一步排除ABO血型不合的HDN。妻子血型丈夫配合血型丈夫不配合血型OOA、B、ABAO、AB、ABBO、BA、ABABO、A、B、AB—Rh陽(yáng)性Rh陽(yáng)性、Rh陰性—Rh陰性Rh陰性Rh陽(yáng)性表10-2夫妻ABO、Rh血型是否相合的判斷產(chǎn)前血型血清學(xué)檢查——母親血清中Ig抗體效價(jià)測(cè)定母親血清中Ig抗體效價(jià)測(cè)定IgG抗A/抗B效價(jià)測(cè)定Rh血型不規(guī)則抗體及效價(jià)檢測(cè)被檢血清以2-巰基乙醇（2-Me）或二硫蘇糖醇（DTT）處理后，IgM類抗體分子裂解為6-7S亞單位。此種亞單位雖然保持與抗原結(jié)合的能力，但已失去與其相應(yīng)紅細(xì)胞凝集的作用。IgG抗體分子則不被2-Me或DTT滅活，保持與相應(yīng)紅細(xì)胞致敏的血清特性。采用抗人球蛋白法檢測(cè)IgG類抗A和（或）抗B效價(jià)。IgG抗A/抗B效價(jià)測(cè)定【標(biāo)本】

孕婦不抗凝靜脈血，標(biāo)本量≥3ml。1.器材

血清學(xué)專用離心機(jī)、37℃水浴箱、試管架、試管(10mm×60mm)、記號(hào)筆、顯微鏡、塑料吸管、玻片、微量加樣器、微柱凝膠孵育器、微柱凝膠離心機(jī)等。2.試劑pH7.4PBS液、0.2mol/L2-巰基乙醇（2-Me）應(yīng)用液或1.0mol/L二硫蘇糖醇（DTT）、抗球蛋白血清試劑、5%A、B型紅細(xì)胞生理鹽水懸液等。用鹽水介質(zhì)排除IgM型抗體的血清，若還有Rh血型不完全抗體可與相應(yīng)紅細(xì)胞結(jié)合，紅細(xì)胞被致敏，由于抗原抗體復(fù)合物分子小、不能形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。加入抗人球蛋白，使紅細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的凝集，從而篩查出紅細(xì)胞血型抗體。一旦抗體被檢出，應(yīng)做抗體鑒定試驗(yàn)。Rh血型不規(guī)則抗體及效價(jià)檢測(cè)1.器材：37℃水浴箱、離心機(jī)、顯微鏡、玻片、試管架、(10mm×60mm)、記號(hào)筆、蠟筆、微量加樣器、一次性塑料吸管、微柱凝膠卡專用孵育器、微柱凝膠離心機(jī)等。2.譜紅細(xì)胞、IgG包被的紅細(xì)胞、pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.2mol/L2-巰基乙醇（2-Me）應(yīng)用液或1.0mol/L二硫蘇糖醇（DTT）、抗球蛋白血清試劑、生理鹽水等。夫婦雙方EDTA抗凝血3-5ml制備紅細(xì)胞懸液，孕婦不抗凝血3-5ml分離血清?！緲?biāo)本】

產(chǎn)前血型血清學(xué)檢查——IgG抗A/抗B效價(jià)測(cè)定處理血清經(jīng)典抗人球蛋白法：操作流程觀察結(jié)果加標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞倍比稀釋排列試管結(jié)果判斷洗滌紅細(xì)胞加PBS加抗球蛋白血清離心并觀察結(jié)果4+：紅細(xì)胞凝集成結(jié)實(shí)大凝塊，背景清晰透明，無(wú)游離紅細(xì)胞。3+：紅細(xì)胞凝集成數(shù)個(gè)凝塊，背景尚清晰，極少游離紅細(xì)胞。2+：紅細(xì)胞凝塊分散成許多中小凝塊，背景稍混濁，周圍可見到游離紅細(xì)胞。1+：肉眼可見大顆粒，背景混濁，鏡下許多凝集，有較多游離紅細(xì)胞。－：紅細(xì)胞呈均勻懸液，鏡下未見紅細(xì)胞凝集，紅細(xì)胞均勻分布。（1）稀釋操作時(shí)要準(zhǔn)確，避免稀釋不勻，出現(xiàn)“跳管”現(xiàn)象。（2）2-Me或DTT應(yīng)用液每次開瓶后要一次用完。（3）IgG抗A(B)效價(jià)測(cè)定，第1管的血清是用等體積的2-Me或DTT應(yīng)用液破壞，故已經(jīng)稀釋一倍，所以起始效價(jià)為2。檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量檢測(cè)產(chǎn)前血型血清學(xué)檢查——IgG抗A/抗B效價(jià)測(cè)定微柱凝膠抗人球蛋白法：操作流程處理血清倍比稀釋排列試管取Coombs微柱凝膠卡離心10分鐘加血清與紅細(xì)胞懸液凝膠卡孵育15分鐘取出并觀察4+：紅細(xì)胞復(fù)合物（凝集）位于凝膠表面。3+：大部分紅細(xì)胞復(fù)合物位于凝膠表面，少部分位于凝膠中上部。2+：大部分紅細(xì)胞復(fù)合物位于凝膠中部，少部分位于凝膠中上部。1+：紅細(xì)胞復(fù)合物位于凝膠中下部分。－：紅細(xì)胞完全沉積在凝膠管尖底部。（1）微柱凝膠卡必須保存在室溫中，使用前應(yīng)檢查微柱凝膠卡是否膠質(zhì)均勻、膠面整齊、有無(wú)氣泡等。（2）紅細(xì)胞標(biāo)本避免受細(xì)菌污染．否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性。（3）在微柱凝膠卡中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，提示為紅細(xì)胞抗原-抗體反應(yīng)，但也不排除其他原因所致溶血，需作認(rèn)真分析。檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量檢測(cè)產(chǎn)前血型血清學(xué)檢查——Rh血型不規(guī)則抗體及效價(jià)檢測(cè)【操作】紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，配制5%紅細(xì)胞懸液壓積紅細(xì)胞加入最適稀釋度抗球蛋白血清試劑1滴，充分混合。加入母親血清1滴。紅細(xì)胞懸液各1滴，混勻。若無(wú)凝集，孵育30分鐘，洗滌3次，最后一次洗滌，棄去上清液，保留壓積紅細(xì)胞。以相對(duì)離心力1000g離心15秒，觀察結(jié)果。若有凝集，取母體血清0.2ml，加2-Me或DTT應(yīng)用液0.2ml混合，封口溫放置30分鐘.以1000g離心15秒，輕輕懸浮細(xì)胞，搖動(dòng)試管，觀察結(jié)果。若檢出不規(guī)則抗體如Rh抗體接著做效價(jià)檢測(cè)，檢測(cè)方法參考IgG抗A/抗B效價(jià)測(cè)定。陽(yáng)性者用譜紅細(xì)胞對(duì)母體血清進(jìn)行特異性分析，以判斷是否存在Rh抗體。陰性者應(yīng)加IgG包被的紅細(xì)胞1滴，離心并觀察結(jié)果：凝集，表示陰性結(jié)果可靠；不凝集，表示試驗(yàn)無(wú)效，必須重做。有溶血和凝集為陽(yáng)性，否則為陰性?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】本試驗(yàn)將鹽水法與抗人球蛋白法相結(jié)合，鹽水法反應(yīng)迅速、方便，但只能檢出IgM抗體，抗人球蛋白法對(duì)于檢查IgG抗體最可靠，但操作步驟稍繁瑣。產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”“三項(xiàng)試驗(yàn)”紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT）血漿（血清）游離抗體試驗(yàn)紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)新生兒血清學(xué)“三項(xiàng)試驗(yàn)”“三項(xiàng)試驗(yàn)”，是對(duì)新生兒溶血病的患兒血清學(xué)進(jìn)行的檢測(cè)。包括直接抗人球蛋白試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱直抗試驗(yàn)）、游離試驗(yàn)和釋放試驗(yàn)。在鹽水介質(zhì)中，不完全抗體可以致敏人紅細(xì)胞，但不能讓紅細(xì)胞凝集。將抗人球蛋白試劑加入紅細(xì)胞懸液中，在致敏紅細(xì)胞間搭橋，使已被不完全抗體致敏的紅細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的凝集，而未被抗體包被的紅細(xì)胞則不會(huì)出現(xiàn)凝集。紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT原理)【標(biāo)本】【器材與試劑】受檢者不抗凝血，采血量≥3ml。1.器材

血清學(xué)專用離心機(jī)、37℃水浴箱、試管架、試管(10mm×60mm)、記號(hào)筆、顯微鏡、塑料吸管、玻片、微量加樣器、微柱凝膠孵育器、微柱凝膠離心機(jī)等。2.試劑多特異性抗球蛋白試劑或抗-IgG和抗-C3d單價(jià)抗球蛋白血清、IgG抗-D致敏的2％～5％RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液、2％～5％正常人紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、Coombs微柱凝集卡等。紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”【操作】試管法：配成5%紅細(xì)胞鹽水懸液陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集標(biāo)明試管屬性均勻分布為陽(yáng)無(wú)凝集則為陰各管加不同的懸液各1滴各管加球蛋白試劑1滴，1000g離心15s秒方法同多特異性抗球蛋白試劑配0.8%紅細(xì)胞懸液1000r/min離心10分鐘標(biāo)記檢測(cè)孔、陽(yáng)性孔和陰性孔置于微柱凝膠孵育器內(nèi)，37℃孵育15分抗多特異性球蛋白試劑50ul紅細(xì)胞懸液分別加入檢測(cè)孔、陽(yáng)性孔和陰性孔取出微柱凝膠卡觀察結(jié)果微柱凝膠介質(zhì)法:洗滌三次50ul待檢全血0.8%紅細(xì)胞懸液孵育離心觀察結(jié)果加入抗多特異性球蛋白試劑50ul微柱凝膠介質(zhì)法試驗(yàn)流程產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”用新生兒血清加上A、B型試劑紅細(xì)胞懸液，做酶法或間接抗人球蛋白試驗(yàn)，并以此試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新生兒血清中是否存在與其紅細(xì)胞不配合的IgG抗-A或抗-B，這些來(lái)自于母親的IgG抗體可與新生兒紅細(xì)胞結(jié)合，引起新生兒溶血病。血漿（血清）游離抗體試驗(yàn)指示紅細(xì)胞意義ABO+--游離的抗A-+-游離的抗B++-游離的抗A、抗B或有抗AB+/-+/-+游離的ABO系統(tǒng)以外抗體---無(wú)游離抗體表10-4游離抗體檢測(cè)意義血漿或血清游離抗體試驗(yàn)【器材與試劑】

用新生兒血清加上A、B型試劑紅細(xì)胞懸液，做酶法或間接抗人球蛋白試驗(yàn)，并以此試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新生兒血清中是否存在與其紅細(xì)胞不配合的IgG抗-A或抗-B，這些來(lái)自于母親的IgG抗體可與新生兒紅細(xì)胞結(jié)合，引起新生兒溶血病。游離抗體檢測(cè)的意義見表10-4.產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”【標(biāo)本】

受檢者不抗凝血，采血量≥3ml。離心分離血清備用微柱凝膠卡放入微柱凝膠孵育器內(nèi)，37℃孵育15分鐘.取Coombs凝膠卡一張分別標(biāo)記Ac、Bc、OcAc、Bc、Oc各加血清50ul，相應(yīng)紅細(xì)胞懸液各50ul1000r/min離心10分鐘，取出Coombs微柱凝膠卡觀察記錄結(jié)果微柱凝膠介質(zhì)法:孵育離心判讀結(jié)果ABoAc丨Bc丨Oc丨微柱凝膠介質(zhì)法【操作】試管法：離心分離血清備用若某管出現(xiàn)凝集，說(shuō)明有相應(yīng)的鹽水抗體取3支試管，分別標(biāo)記Ac、Bc、Oc加入5％A、B、O型試劑紅細(xì)胞懸液各1滴，37℃30min1000g離心15秒，肉眼及顯微鏡下觀察產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”

紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)是診斷HDN的主要依據(jù)。釋放試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性應(yīng)診斷HDN。因致敏紅細(xì)胞通過(guò)某種方法將抗體釋放出來(lái)，而釋放液中抗體的特異性可用已知抗原的紅細(xì)胞來(lái)確定。常用的方法有：加熱放散法、冷放散法和乙醚放散法。

紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”【操作】加熱放散法：紅細(xì)胞洗滌3次，3000r/min離心5分，加入等量的生理鹽水，混勻分離上清液置于另一支試管中即為放散液置于56℃水浴振搖10分鐘立即以1000g離心2分鐘取潔凈試管3支

加入相應(yīng)的酶處理紅細(xì)胞1滴，37℃孵育30min洗滌3次，棄上清，各管加入多特異性抗人球蛋白試劑2滴

以1000g離心15秒，觀察結(jié)果【原理】

結(jié)合在紅細(xì)胞上的抗體可以采用加熱的方式進(jìn)行分離，然后再進(jìn)行抗體種類鑒定。用生理鹽水洗滌待檢標(biāo)本紅細(xì)胞，將離心后形成的壓積紅細(xì)胞放入56℃水浴中振搖一定時(shí)間后，再高速離心后取上清液與已知紅細(xì)胞反應(yīng)看是否凝集來(lái)鑒定放散液中抗體的種類。常用于AB0-HDN抗體放散試驗(yàn)?！緲?biāo)本】受檢者抗凝血，采血量≥3ml。加熱放散法ErythrocytewithboundantibodsElutionofantibodiesbyheatDissociatedantibodies【器材與試劑】（1）器材

血清學(xué)專用離心機(jī)、37℃水浴箱、56℃水浴箱、試管架、試管(10mm×75mm)、記號(hào)筆、微量加樣器、一次性塑料滴管等。（2）試劑

生理鹽水、（A、B、O）2％～5％酶處理指示紅細(xì)胞、多特異性抗人球蛋白試劑等。Destroyederythrocyte產(chǎn)后血型血清學(xué)檢查——“三項(xiàng)試驗(yàn)”鹽水洗滌3次，3000r/min離心5分鐘，棄上清，加等體積的鹽水和2倍無(wú)水乙醚緊試管口振搖10分鐘取另一支試管，加入放散液2滴，再加標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞懸液1滴，37℃孵育30分鐘，棄上清，加抗人球蛋白血清1滴離心力1000g離心5分鐘取試管上層為乙醚層

中間層為紅細(xì)胞層，下層為放散液層下層深紅色的放散液移至另一支試管中置于37℃孵育30分鐘，除盡乙醚。離心力1000g離心15秒，輕彈試管，肉眼觀察，必要時(shí)在顯微鏡下觀察，記錄凝集情況【操作】乙醚放散法：乙醚放散法ErythrocytewithboundantibodsElutionofantibodieswithether【原理】乙醚為有機(jī)溶劑，通過(guò)破壞紅細(xì)胞膜，使結(jié)合在紅細(xì)胞膜上的IgG抗體解離，再應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞測(cè)定放散液中抗體的特異性。可檢測(cè)吸附于紅細(xì)胞上的各種IgG抗體。常用于Rh-HDN抗體放散試驗(yàn)。【標(biāo)