《百香果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》

Q/LB.□XXXXX-XXXX百香果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法范圍本文件規(guī)定了利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記進(jìn)行百香果品種鑒定的操作程序、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)、判定方法。本文件適用于百香果品種SSR指紋數(shù)據(jù)采集及品種真實(shí)性鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T2517植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南西番蓮NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法總則術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。推薦引物recommendedprimer品種鑒定中優(yōu)先選用一套簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）引物，其檢測(cè)位點(diǎn)具有多態(tài)性高、重復(fù)性好等綜合特性。對(duì)照品種controlvariety對(duì)照品種具有所用SSR位點(diǎn)上不同等位變異的特性。對(duì)照品種用于輔助確定待測(cè)樣品的等位變異，校正儀器設(shè)備的系統(tǒng)誤差。原理不同品種百香果的遺傳組成不同，其基因組（DNA）中SSR的重復(fù)次數(shù)存在差異，根據(jù)SSR的差異，通過(guò)PCR擴(kuò)增及電泳技術(shù)可以鑒定百香果品種。材料和試劑除另有說(shuō)明外，本標(biāo)準(zhǔn)中使用分析純（含）以上試劑，水為符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水，其中PCR用水要求達(dá)到一級(jí)水指標(biāo)。試劑三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：純度＞99%。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)：純度≥99.0%。硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm3，含量≥99.5%。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：ρ=1.32g/mL，純度≥99.0%。氯化鈉（NaCl）：ρ=2.165g/cm3，含量≥99.5%。瓊脂糖。過(guò)硫酸銨（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm3，含量≥98.0%。氫氧化鈉(NaOH）：ρ=2.13g/cm3，含量≥96.0%。硝酸銀（AgNO3）：ρ=4.35g/cm3，含量≥98.0%。甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm3。液氮（N2）：ρ=0.81g/cm3。三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm3。無(wú)水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm3，含量≥99.7%。DNA分析儀用LIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)。去離子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAmarker）：可以清楚區(qū)分50bp～500bp的DNA片段。2×TaqPlusPCR預(yù)混試劑：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μmol/LdNTPeach、20mmol/LTris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mMMgCl2、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑。溶液配制5×TBE緩沖液稱(chēng)取5.4g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）和2.75g硼酸（5.1.3）溶于70mL純水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。0.5×TBE緩沖液量取100mL濃度5×TBE（5.2.1）緩沖液于燒杯中，加入900mL純水混勻。CTAB提取溶液稱(chēng)取4g十六烷基三甲基溴化銨（5.1.4）、16.38g氯化鈉（5.1.5）、1.21g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、1.49g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）溶于70mL純水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。無(wú)菌純水純水在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。1%瓊脂糖溶液1g瓊脂糖（5.1.6）溶于100mL的0.5×TBE緩沖液（5.2.2），適當(dāng)加熱融化。10%過(guò)硫酸銨溶液稱(chēng)取10g過(guò)硫酸銨（5.1.7），加入100mL純水溶解。電泳緩沖液稱(chēng)取108g三羥甲基氨基甲烷（5.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二鈉（5.1.2）、55g硼酸（5.1.3）、0.8g氫氧化鈉（5.1.8），加入10L純水溶解。染色液稱(chēng)取0.2g硝酸銀（5.1.9），加入400mL純水溶解。顯色液稱(chēng)取4g氫氧化鈉（5.1.8），加入400mL純水溶解，臨用時(shí)再加1.6mL甲醛（5.1.10）。儀器和設(shè)備電子天平：感量為1mg。水浴鍋。高速冷凍離心機(jī)。PCR擴(kuò)增儀。垂直板電泳系統(tǒng)。凝膠成像系統(tǒng)。毛細(xì)管電泳儀。膠片觀察燈。SSR引物序列信息引物序列信息見(jiàn)附錄A。操作步驟樣品采集用不銹鋼剪刀采集種植的已知品種的百香果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標(biāo)識(shí)，放入0-8℃保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆?。DNA的提取取8.1中適量百香果葉片用自來(lái)水沖洗干凈，再用純水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼剪刀剪碎放入研缽中，加入液氮（5.1.11）研磨成粉末狀，分取100mg放入1.5mL離心管中，加入750μLCTAB提取溶液（5.2.3），渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min~60min，期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500μL的三氯甲烷（5.1.12），顛倒混勻，12000rpm離心3min，轉(zhuǎn)移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等體積（即0.5mL）預(yù)冷至約4℃的無(wú)水乙醇（5.1.13），顛倒混勻，-18℃冰箱下靜置1h，12000rpm離心3min，去上清液，室溫下干燥沉淀。加入50μL無(wú)菌純水（5.2.4）于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法也適用于本規(guī)程。PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系試劑終濃度體積滅菌純水-8.5μL2×TaqTaqPlusPCR預(yù)混試劑1×12.5μL10μmol/L正向引物0.4μmol/L1.0μL10μmol/L反向引物0.4μmol/L1.0μL25ng/μLDNA模板2.0ng/μL2.0μL總體積25.0μLPCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度見(jiàn)附錄A推薦引物表），72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃下延伸7min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠制備在一對(duì)玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1%瓊脂糖溶液（5.2.5），讓其凝固密封。在50mL量杯中依次加入7.5mL5×TBE緩沖液（5.2.1），7.5mL40%Acryl/BisSolution(29:1)（5.1.16），攪拌并用純凈水定容至30mL；加入200μL10%過(guò)硫酸銨（5.2.6）和12μL四甲基乙二胺溶液（5.1.17），混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在50min~60min內(nèi)聚合凝固，凝膠高度應(yīng)不小于10cm。電泳將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液（5.2.7），小心拔下樣品梳。用加樣器吸取1μL不同引物（附錄A）PCR產(chǎn)物，加入樣品孔中，同時(shí)在同一塊膠中加入1μLDNAmarker（5.1.18）。電泳選用的電壓梯度為1~5V/cm，2×TaqPlus預(yù)混試劑（5.1.19）的藍(lán)色指示帶從上到下分別到達(dá)膠板1/2、2/3處（大約1h）后結(jié)束電泳。銀染顯色將附著凝膠的玻璃板用去離子水沖洗30s~60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤(pán)中，加入染色液（5.2.8）覆蓋凝膠，輕搖5min~10min進(jìn)行染色；倒掉染色液，用去離子水快速漂洗，放入顯色液（5.2.9）中，輕搖至顯色出清晰帶紋；取出凝膠用純水沖洗兩遍，瀝干后進(jìn)行拍照。毛細(xì)管電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備分別取等體積的稀釋后不同引物（附錄A）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液混合，從混合液中吸取1μL按序號(hào)加入到DNA分析儀專(zhuān)用96孔板孔中，板中各孔分別再加入0.1μLDNALIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)（5.1.14）和8.9μL去離子甲酰胺（5.1.15）。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，迅速置于碎冰塊上，冷卻10-15min。將整個(gè)96孔板置于離心機(jī)中，離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。電泳檢測(cè)按照儀器操作規(guī)程，編輯樣品表及運(yùn)行程序，執(zhí)行運(yùn)行程序，儀器自動(dòng)給出檢測(cè)結(jié)果，保存并記錄數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)樣品每個(gè)SSR位點(diǎn)等位變異采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度表示；對(duì)于毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，使用對(duì)照品種消除DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取位點(diǎn)等位變異。對(duì)于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法，將待檢樣品與對(duì)照品種的等位變異片段進(jìn)行比較，明確待檢樣品位點(diǎn)等位變異。純合位點(diǎn)結(jié)合等位變異大小數(shù)據(jù)記為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大??；雜合位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點(diǎn)上的2個(gè)等位變異的大小，小片段數(shù)據(jù)在前、大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為0/0。樣品在某個(gè)位點(diǎn)上僅出現(xiàn)1個(gè)等位變異，大小為160bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/160。樣品在某個(gè)位點(diǎn)上僅出現(xiàn)2個(gè)等位變異，大小為160bp、165bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/165。判定方法當(dāng)待檢樣品和對(duì)照品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，則判定為“不同品種”；當(dāng)待檢樣品和對(duì)照品種間差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為“近似品種”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為“極近似品種或相同品種”。

（規(guī)范性）

推薦引物推薦引物見(jiàn)表A.1引物編號(hào)及引物擴(kuò)增信息序號(hào)引物名稱(chēng)條帶大?。╞p）引物退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）1PeRM1000195-10750正向：GCATGGACTTGATTTGTATATTCT反向：GAGAACAATGATGTCACTTTCATA2PeRM1000598-14050正向：TAGTGACATAACTGAAAACGCTAT反向：GAGTTACCGCTGAAGTTTTCTA3PeRM10006149-19050正向：TCATTAACATCGTAAACAAAGATT反向：AATTCGACAAGATTTACTGATACA4PeRM1000795-10650正向：GTAGTAGGAGAATATTTGAGGGAA反向：CTATTTTGTGATCCAAGGAAGT5PeRM10008105-12350正向：GTCACTATCATCCCATAAAAATTC反向：AGGTAAAATTAATATGATAAGCGAA6PeRM10009135-14550正向：GATTGATTTGTGGATGGATACT反向：CACTTGTTTCACTCGTACAATAAT7PeRM10011120-13010955正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’反向：AGAGATATTTTTCACTCACTGGAT8PeRM10012135-18015150正向：CTCCATATCAGATTAAGTAACCAC反向：CTCAAATAAAAACAAACCTGTTAC9PeRM10014130-14050正向：CATTTATAAAGGAATTGACAAGAA反向：CTGAGTTAATGCTGTGATTAAGAT10PeRM1001614950正向：AATTTTCTTGGCTTAAAACACTAC反向：TTGACTTCACTGCTATGGTATTAG11PeRM10017146-17650正向：AAGACACTGATAGTTCTCTGAGG反向：CAAATTATGATAAGAAACTTGGAA12PeRM10018160-17050正向：ACAGAAAAGAAAGATAAAGCAAAT反向：TTCAGTATCCAACTGAACACAC13PeRM10019142-15050正向：TGGTAGTCAATCAGAAAACTAAGA反向：GAGTTGTTAGGTCTCCTCAACTTA14PeRM10020132-14250正向：AACAGGGTATACTGTAAATCATTG反向：GTTTATTCCTTTCTCTTCTAGTGC15Pa_F-P10A1022050正向：TGGAATGTGATTTGCATGG反向：TAGGTATTGCTGGCGAAG16Pa_F+R-Contig11429050正向：CTTGCCTCTCTCCCTCTC反向：GGGTTTTGGGTTTGACAG表A.1引物編號(hào)及引物擴(kuò)增信息（續(xù)）序號(hào)引物名稱(chēng)條帶大小（bp）引物退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）17Pa_F-Contig1329350正向：CAGAAGGAAAACCAGCAAG反向：CCCCATCATCATCACTTTC18Pa_F-P7E10240-25550正向：TTAATGCCACAGCCCAAC反向：TGACCCAAAATCAAACACC19Pa_F+R-Contig80360-38055正向：TGTTCAAGCCCATCTTCG反向：GCTCTCGCTCTTGTCGTAG20Pa_F-P6H04280-29555正向：GAATAGGGTCAGCAGGAGG反向：GAGTGTGTCATCGGAGTCC21PE222353正向：GATCGGTCCTCGGTTAGAC反向：AGTCACACAGCATGAGAAATC22PE625853正向：GCAATTTCACCATCTTCTGCT反向：CCACGGTCATGGATGTTC