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18醫(yī)藥基因工程第十七章醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程自1972年DNA重組技術(shù)誕生以來,基因工程技術(shù)得到飛速發(fā)展,并在醫(yī)療領(lǐng)域中展露出獨特的優(yōu)越性?;蚬こ趟幬锞褪抢没蚬こ碳夹g(shù)生產(chǎn)的藥物。基因工程藥物是將藥物蛋白或多肽的編碼基因通過特定的受體細(xì)胞中,通過受體生物或者細(xì)胞表達(dá)出藥物蛋白或多肽,最后將其純化并制成藥劑的過程。基因工程藥物生產(chǎn)的過程與其他基因工程產(chǎn)品的基本原理是相通的,基本過程都包括了載體構(gòu)建,工程菌或細(xì)胞培養(yǎng),目的產(chǎn)物的分離純化與鑒定等。18醫(yī)藥基因工程從1982年最早的基因工程藥物--胰島素上市到2004年底,已經(jīng)有100多種基因工程藥物通過審查并上市,另外還有300多種基因工程藥物進(jìn)入二期及三期臨床實驗,涉及治療150多種疾病。我國于1993年批準(zhǔn)了第一個基因工程藥物重組人干擾素a-1b的生產(chǎn),標(biāo)志著我國基因工程藥物生產(chǎn)實現(xiàn)了零的突破。我國藥品市場上基因工程藥品主要有基因工程乙肝疫苗,重組干擾素,重組人紅細(xì)胞生成素等22種自主開發(fā)的基因工程藥物。18醫(yī)藥基因工程第一節(jié)基因工程藥物的開發(fā)狀況18醫(yī)藥基因工程一.基因工程藥物的分類1.按照結(jié)構(gòu)組成不同分類:蛋白多肽類藥物,基因工程疫苗和核酸類藥物三類。2.按照作用方式分類:基因水平作用藥物,轉(zhuǎn)錄水平作用藥物和蛋白質(zhì)水平作用藥物。18醫(yī)藥基因工程3.按照藥物作用機(jī)理分類:其一:蛋白或多肽藥物,通過蛋白自身的生理生化特性而抵抗疾病其二:基因工程疫苗,基因工程抗體和DNA疫苗,基于抗原抗體反應(yīng)的原理而抵抗疾病其三:反義核酸,核酶和RNAi,基于中斷基因表達(dá)而抵抗疾病。18醫(yī)藥基因工程二.基因工程藥物的發(fā)展1.反應(yīng)器的變遷根據(jù)反應(yīng)器的不同可將蛋白多肽類基因工程藥物的發(fā)展分為三個階段:
a.早期大多數(shù)蛋白多肽類基因工程藥物通過細(xì)菌和酵母等微生物來表達(dá)。
b.后來發(fā)展了真核生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),利用離體培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞和脊椎動物(如哺乳動物和鳥類)細(xì)胞表達(dá)蛋白多肽類藥物。
c.近年來發(fā)展的動植物生物反應(yīng)器為基因工程藥物的開發(fā)帶來美好的前途。18醫(yī)藥基因工程2.從基因工程到蛋白質(zhì)工程隨著技術(shù)的進(jìn)步,人們通過蛋白質(zhì)工程可獲得修改了氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。通過定點突變、功能域的交換、分子進(jìn)化等手段,已經(jīng)開發(fā)了一些活性提高、適應(yīng)性改善和專一性增強(qiáng)的蛋白藥物。3.從蛋白藥物到核酸藥物
傳統(tǒng)藥物是通過增加某些人體內(nèi)源性的有益蛋白多肽或者破壞致病蛋白本身來治療疾?。欢怂犷惢蚬こ趟幬飫t是提供產(chǎn)生蛋白的基因,通過破壞或者擴(kuò)大基因的功能來克服疾病?;蚬こ趟幬锏拈_發(fā)關(guān)鍵在于探知什么蛋白或多肽、或核酸可以成為藥物,已經(jīng)通過什么樣的方式制備藥物或通過什么樣的方式使用藥物。18醫(yī)藥基因工程三.基因工程藥物的產(chǎn)業(yè)化狀況第一個基因工程藥物--基因工程人胰島素的問世期間經(jīng)歷了不到十年。至1976年第一個以基因工程制藥為對象的美國Genentech公司成立以來,有藥物進(jìn)入臨床實驗的生物技術(shù)公司已有約500個。在2002年,超過80種基因工程藥物獲準(zhǔn)在美國和歐盟使用,750中正在進(jìn)行臨床實驗,市場份額超過150億美元。我國共有22種基因工程藥物和疫苗,其中4種為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的”一類“新藥,進(jìn)入臨床研究的大約有150種,銷售收入超過3億人民幣。18醫(yī)藥基因工程表18醫(yī)藥基因工程第二節(jié)基因工程蛋白和多肽藥物18醫(yī)藥基因工程一.基因工程胰島素1.胰島素與糖尿病
胰島素(insulin)是一種激素,能夠調(diào)節(jié)糖代謝,促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃Υ嬗诩∪夂透蝺?nèi)。當(dāng)人體胰腺的B-細(xì)胞不能產(chǎn)生足量的胰島素時,就會導(dǎo)致人體內(nèi)的葡萄糖濃度增高,并伴隨因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂,即糖尿病。而對于胰島功能完全消失的Ⅰ型糖尿病患者,不注射胰島素就無法維持生命。18醫(yī)藥基因工程2.胰島素的結(jié)構(gòu)胰島素是一種由兩條多肽鏈(A鏈和B鏈)組成的蛋白質(zhì)。A鏈含有21個氨基酸,B鏈含有30個氨基酸,鏈間通過二硫鍵結(jié)合。胰島素在人體內(nèi)合成的過程中首先合成前胰島素原(preproinsulin),包括信號肽序列、A鏈、B鏈和連接序列4個部分。胰島素是經(jīng)過去掉信號肽序列后形成胰島素原,去掉連接序列后剩下的A鏈和B鏈通過二硫鍵結(jié)合,形成了胰島素。(圖18—1)18醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程3.基因工程胰島素的生產(chǎn)方式主要有兩種生產(chǎn)方式:
a.利用大腸桿菌為受體,分別表達(dá)胰島素A鏈和B鏈,再分別提取和純化產(chǎn)生的A鏈和B鏈,最后利用化學(xué)方法使兩條鏈之間形成二硫鍵,從而得到胰島素。
b.以酵母為受體分泌表達(dá)人胰島素。在胰島素編碼基因前段增加一個信號肽編碼序列,這個信號肽引導(dǎo)合成的胰島素從細(xì)胞內(nèi)分泌到周圍的培養(yǎng)基中,從而簡化了胰島素的純化過程,最后通過酶學(xué)反應(yīng)使之變成人胰島素。18醫(yī)藥基因工程二.基因工程人紅細(xì)胞生成素1.人紅細(xì)胞生成素的組成和生物活性
成熟的人紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種由165個氨基酸組成的糖蛋白,多肽結(jié)構(gòu)中由4個半胱氨酸形成2條二硫鍵,相對分子質(zhì)量為34×103
EPO又稱促紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生產(chǎn)刺激因子,是一類造血生長因子,刺激和調(diào)節(jié)哺乳動物紅細(xì)胞的生成,維持外周血紅細(xì)胞處于正常水平。
腎是產(chǎn)生EPO的主要器官,目前只有應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)EPO才能滿足患者的需求。18醫(yī)藥基因工程2.重組紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)人類EPO位于第7號染色體長22區(qū),1985年克隆到其cDNA。由于糖基化的問題,目前只利用脊椎動物表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素,其糖基化特性與人體中自然產(chǎn)生的糖基化特性最相近。方法:通過將編碼人紅細(xì)胞生成素的基因裝入哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶缺陷的CHO細(xì)胞(CHO-dhfrˉ)株,并進(jìn)一步篩選獲得高產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素的CHO。經(jīng)過一系列細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)純化等工藝制備過程,產(chǎn)生有生物學(xué)活性的重組人EPO?,F(xiàn)在上市的紅細(xì)胞生成素主流產(chǎn)品都是通過基因重組技術(shù),利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese
hamster
ovary,CHO)生產(chǎn)的。18醫(yī)藥基因工程三.基因工程干擾素1.干擾素的結(jié)構(gòu)組成、生物活性和臨床應(yīng)用
干擾素(interferon,IFN)是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白細(xì)胞因子,最早于1957年發(fā)現(xiàn)。干擾素是一類多功能細(xì)胞因子,按其結(jié)構(gòu)和功能的差異可以分為三類,即干擾素α
、干擾素β和干擾素γ。干擾素α含有23種不同的亞型,干擾素β和干擾素γ都只有1種亞型。干擾素α的成熟產(chǎn)物由165~166個氨基酸組成,其中含4個半胱氨酸,形成對生物活性至關(guān)重要的2個二硫鍵。干擾素α主要由白細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞分泌;臨床上主要用來治療白血病,以及一些慢性病毒,如乙型肝炎、丙型肝炎和皰疹病毒感染。
18醫(yī)藥基因工程2.基因工程干擾素的生產(chǎn)早期制備是通過誘導(dǎo)或重組誘導(dǎo)天然或人工培養(yǎng)的人體細(xì)胞或血細(xì)胞產(chǎn)生天然干擾素。利用基因工程生產(chǎn)干擾素:
a.先要獲得干擾素的編碼基因;
b.利用誘生劑誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)干擾素;
c.然后提取干擾素的mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
d.將干擾素編碼基因通過合適的表達(dá)載體,導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)可產(chǎn)生大量干擾素;
e.經(jīng)過分離純化便可制成藥物制劑。18醫(yī)藥基因工程四、基因工程疫苗疫苗的定義:由滅活或減毒的病原體做成的可預(yù)防相應(yīng)病原物引起疾病的藥物,通過接種人或動物在其體內(nèi)建立抗感染免疫反應(yīng)而產(chǎn)生保護(hù)作用。1.基因工程疫苗的分類:
a.亞單位疫苗。指用病原體的組分制成的疫苗,包括病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)菌的脫毒毒素蛋白,其中病毒的結(jié)構(gòu)蛋白是指病毒組成成分中能引起人體對病毒顆粒產(chǎn)生免疫反應(yīng)且不致病的蛋白組分;細(xì)菌脫毒毒素蛋白是利用DNA重組技術(shù)在基因水平上對細(xì)菌的毒素蛋白進(jìn)行脫毒所獲得的基因工程疫苗。
b.無毒疫苗或減毒活疫苗。利用DNA重組技術(shù)去掉致病菌的毒素基因后得到的即保留了其侵入細(xì)胞和刺激免疫系統(tǒng)的能力,卻又不能引起疾病的減毒病原菌。
c.疫苗載體。把目的基因轉(zhuǎn)到已經(jīng)在臨床上使用的安全的活疫苗中,利用該活疫苗作為載體表達(dá)目的抗原基因,從而達(dá)到針對某種傳染病的免疫保護(hù)作用。
18醫(yī)藥基因工程2.重組乙型肝炎疫苗乙型肝炎的定義:由乙型肝炎病毒(HBV)引起的、以肝為主要病變并可累及多器官損害的一種傳染病。乙型肝炎病毒顆粒由囊膜和含有DNA分子的核衣殼組成,又稱Dane顆粒。最初的乙型肝炎疫苗都是血液乙型肝炎疫苗,是從乙型肝炎患者血液中分離提取乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。疫苗的制備一般選定具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原基因片段,將起插入表達(dá)載體,并引入到與表達(dá)載體相對應(yīng)的宿主細(xì)胞,構(gòu)成重組體。重組體像一個加工廠,可以表達(dá)、加工、生產(chǎn)出乙型肝炎表面抗原,即得到基因工程疫苗。18醫(yī)藥基因工程(1).重組酵母乙型肝炎疫苗用來表達(dá)抗原的酵母主要是釀酒酵母、漢遜酵母和畢赤酵母。表達(dá)質(zhì)粒上用來在酵母中表達(dá)HBsAg的主要部件有3個:⑴在酵母中表達(dá)HBsAg的啟動子。⑵不含有內(nèi)含子的乙型肝炎病毒HBsAg的基因。⑶在酵母細(xì)胞中終止HBsAg轉(zhuǎn)錄的DNA序列。利用酵母細(xì)胞表達(dá)HBsAg存在缺點:⑴酵母細(xì)胞不能分泌HBsAg顆粒;⑵酵母細(xì)胞對HBsAg蛋白的糖激化與哺乳動物的不同,使得獲得的酵母HBsAg可能具有與血液HBsAg不同的免疫原性;⑶在酵母中裝配22nmHBsAg
顆粒不穩(wěn)定;⑷酵母細(xì)胞產(chǎn)生的HBsAg需要化學(xué)方法處理才能與血液的HBsAg相同,在這過程中可能改變HBsAg分子的結(jié)構(gòu),從而減小HBsAg抗原性。18醫(yī)藥基因工程(2).重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)乙型肝炎疫苗將乙型肝炎表面抗原基因片段重組到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)內(nèi),通過對細(xì)胞的培養(yǎng)增殖,分泌乙型表面抗原(HBsAg)于培養(yǎng)液中,經(jīng)純化,加佐劑氫氧化鋁后制成疫苗。優(yōu)點:⑴CHO乙型肝炎疫苗產(chǎn)生的HBsAg的糖基化與血液HBV顆粒的糖基化一樣;⑵產(chǎn)生的HBsAg顆粒是以自然方式裝配的,而不需要其他的化學(xué)處理;⑶裝配的22nmHBsAg顆粒最后會被分泌到培養(yǎng)基中,不需要裂解細(xì)胞,簡化了純化步驟;⑷成本不高,有利于那些負(fù)擔(dān)不起現(xiàn)有的高價疫苗的患者。18醫(yī)藥基因工程五.基因工程抗體抗體的定義:是機(jī)體受抗原刺激后由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白,是體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮免疫功能的最主要的免疫分子,主要分布與血清中,在組織液和外分泌液中也存在。常規(guī)抗體是針對多種不同抗原決定蔟產(chǎn)生的抗體,又稱多克隆抗體;而針對某種抗原決定蔟的抗體稱單克隆抗體,一般由雜交瘤細(xì)胞分泌。在臨床上,抗體可用于抗腫瘤、抗感染、抗器官移植排斥反應(yīng)、抗血栓形成和解毒,以及構(gòu)建獨特型疫苗、治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)疾病,此外還可用于體外診斷和發(fā)揮體內(nèi)藥物導(dǎo)向作用?;蚬こ炭贵w在臨床上可發(fā)揮更多更重要的作用。18醫(yī)藥基因工程第三節(jié)基因工程抗體18醫(yī)藥基因工程一.抗體的結(jié)構(gòu)抗體分子是由4條多肽鏈組成的四聚體,即由2條相同的輕鏈(L)和2條相同的重鏈(H)組成,重鏈之間以及輕鏈之間通過二硫鍵連接,呈Y字型結(jié)構(gòu)(圖18-2)。重鏈由450個氨基酸組成(如抗體IgG),輕鏈由214個氨基酸組成,完整抗體的相對分子質(zhì)量約為150×103??乖淖R別位點位于輕鏈和重鏈的N端區(qū)域,該區(qū)稱稱作抗體的可變區(qū)(V區(qū)),識別位點就在V區(qū)內(nèi)的3個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),也稱超變區(qū),每個CDR長約5~16個氨基酸。V區(qū)以外的部分稱為框架區(qū)(FR),其氨基酸序列相對保守,不與抗原分子直接結(jié)合,可維持抗體的空間構(gòu)型??贵w分子含有多個功能區(qū),除V區(qū)外,每一條輕鏈含有1個保守區(qū)(C區(qū))CL,每一個重鏈含有3個保守區(qū)(CH1、CH2、CH3)。18醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程二.天然抗體的局限性抗原有多種不同抗原決定蔟,可刺激產(chǎn)生多克隆抗體。這種抗原是不均一的,會影響檢測抗原的特異性及敏感性,在臨床上應(yīng)用受到很大限制。單克隆抗體的定義:是由識別一種抗原決定蔟的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一抗體,可視為第二代抗體,具高度特異性、均一性,且親和力強(qiáng)、效價高,在臨床上發(fā)揮了重要作用。單克隆抗體在臨床中的問題:⑴單克隆抗體具有免疫原性;⑵雜交瘤制備的單克隆抗體在人體內(nèi)的半衰期只有5~6h,不利于藥效發(fā)揮作用;⑶吸收差,抗體相對分子質(zhì)量大,很難通過血管進(jìn)入細(xì)胞間隙,大大降低治療效果;⑷生產(chǎn)復(fù)雜,價格較高。18醫(yī)藥基因工程三.基因工程抗體的種類1.單克隆抗體的人源化為了解決鼠源抗體的免疫原性問題,應(yīng)改造抗體,構(gòu)建人-鼠嵌合抗體和人源化抗體。
a.人-鼠嵌合抗體通過基因重組,將鼠源單克隆抗體的Fv片段替換人源抗體的相應(yīng)片段,制成人-鼠嵌合抗體(圖18-3)。70%序列來自人源抗體,30%序列來自鼠源抗體;可保留抗體的特異性結(jié)合位點,也可減弱其免疫原性。
b.人源化抗體是對嵌合抗體進(jìn)一步改進(jìn)的結(jié)果,即用鼠源單克隆抗體的CDR所獲得的雜合抗體,95%序列來自人源抗體,5%的序列來自鼠源抗體,最大限度地使鼠源抗體人源化(圖18-4)??贵w的抗原結(jié)合特性保留,在人體內(nèi)產(chǎn)生免役原性的程度降到最低。18醫(yī)藥基因工程
18醫(yī)藥基因工程2.小分子抗體為了解決穿透性問題,對抗體改造,保留抗原結(jié)合位點,成為小分子抗體,分為下面5種:
a.Fab抗體抗體的Fab片段由重鏈的V區(qū)和Cm區(qū)與輕鏈以二硫鍵相連,能發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能,大小為完整抗體的1/3。
b.單鏈抗體將抗體的VH和VL用連接肽連接,形成具有抗原結(jié)合能力的單鏈抗體多肽,即所謂的單鏈抗體(ScFv)。其大小僅為完整抗體的1/6,免疫原性弱,藥物動力學(xué)優(yōu)于Fab片段和完整抗體,能有效到達(dá)完整抗體無法達(dá)到的靶部位。18醫(yī)藥基因工程
c.單域抗體抗體結(jié)合抗原的部位主要在V區(qū),只含有V區(qū)的小分子抗體,如VH或VL,也能保持原單克隆抗體的特異性,這種小分子抗體稱為單域抗體,其大小為完整抗體的1/12,其只有一個功能區(qū),制備簡單,更容易穿過靶細(xì)胞。
d.超變區(qū)多肽由單個CDR多肽構(gòu)成的小分子抗體稱為超變區(qū)多肽,其只有16~30個氨基酸,具有與抗原結(jié)合的能力,穿透力極強(qiáng)。但親和力低,穩(wěn)定性不高,實際應(yīng)用有很大局限性。
e.雙體抗體將兩種不同抗體的VH區(qū)和VL區(qū)通過連接肽(5~10個氨基酸)連接,形成“雜交”的單鏈抗體稱作雙體抗體(diabody),也稱雙特異性抗體。在宿主細(xì)胞中表達(dá)后,2條鏈自動折疊,形成雙特異性的抗體片段,其大小為IgG的1/3或Fab的1/2,是相對分子質(zhì)量最小的雙功能抗體,在免疫診斷和治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。18醫(yī)藥基因工程3.雙功能抗體雙功能抗體的定義:天然的抗體分子是雙價單特異性的,將小分子抗體(如Fab或Fv)與其他蛋白如毒素、酶、細(xì)胞因子及受體分子連接在一起,可形成一種新型分子,這樣的雜和分子稱雙功能抗體。雙功能抗體即可以與靶位點結(jié)合,又可將特定的活性分子導(dǎo)向特定部位,發(fā)揮其生物學(xué)功能,如殺死腫瘤細(xì)胞、發(fā)揮催化功能等。將人細(xì)胞受體或黏附分子與抗體的恒定區(qū)(主要是Fc片段)的N段連接,形成免疫黏連素,既可發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能,又能發(fā)揮細(xì)胞黏附功能。對于殺傷缺少相應(yīng)表面抗原的腫瘤細(xì)胞有一定意義,可減少腫瘤的免疫逃逸。18醫(yī)藥基因工程4.人源性抗體制備人源單克隆抗體的2種方法:
a.噬菌體抗體庫噬菌體抗體庫技術(shù)是噬菌體表面展示技術(shù)在基因工程抗體應(yīng)用上的一個成功范例;通過噬菌體表面展示技術(shù),可將目的蛋白或多肽的編碼基因與編碼M13噬菌體顆粒末端蛋白的基因Ⅲ構(gòu)建成融合基因,將含有融合基因的重組M13噬菌體轉(zhuǎn)染大腸桿菌,可以在噬菌體顆粒表面展示目的蛋白。(圖18-5)18醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程b.人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠,可使小鼠產(chǎn)生人源性單克隆抗體。用人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠并替代小鼠的相應(yīng)基因,產(chǎn)生能分泌人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠,第一個獲得的人源性抗體是抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體。在轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)上,建立了一種產(chǎn)生人抗體的小鼠模型XenoMouse。將小鼠的全套抗體基因敲除掉,同時將人的大部分輕鏈和重鏈基因插入到小鼠的染色體中,當(dāng)用抗原刺激小鼠時就可產(chǎn)生人源性抗體。利用該模型已制備了多種類型的人單克隆抗體,如抗人表皮生長因子受體的人源性抗體。18醫(yī)藥基因工程5.基因工程抗體的產(chǎn)生⑴大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)⑵酵母表達(dá)系統(tǒng)⑶哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)⑷植物表達(dá)系統(tǒng)⑸昆蟲表達(dá)系統(tǒng)18醫(yī)藥基因工程第四節(jié)核酸類藥物18醫(yī)藥基因工程一.反義核酸藥物反義核酸是一些人工合成的單鏈反義分子,可以通過堿基互補(bǔ)原則與被感染細(xì)胞內(nèi)的某個靶標(biāo)mRNA或DNA結(jié)合,抑制或封閉該基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),或切割mRNA使其喪失功能。反義核酸作為藥物可以治療正常蛋白超量表達(dá)的疾病,如癌癥,炎癥,病毒或寄生蟲感染。根據(jù)組成的特點可將其分為反義RNA,反義DNA,肽核酸和核酶。18醫(yī)藥基因工程1.反義RNA機(jī)理:利用反義RNA可以與mRNA結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈,阻斷核酸蛋白體同mRNA的結(jié)合,從而抑制了mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。反義RNA在細(xì)胞核中與mRNA結(jié)合后會干擾其加工和剪切,如加帽和加poly(A)尾,還會干擾mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。反義核酸和mRNA結(jié)合后還使得mRNA更加易被核酸識別而降解,從而大大縮短mRNA的半衰期。反義RNA除了可以影響基因的表達(dá)外,還可與引物RNA前體互補(bǔ)結(jié)合,從而抑制DNA復(fù)制。反義RNA可以人工合成,更多的是將目的DNA以反方向插入載體通過反義表達(dá)載體產(chǎn)生。通過這些載體可用于研發(fā)新型,高特異性和高效的反義治療藥物,在治療艾滋病和麻疹以及惡性腫瘤方面起到了一定作用。18醫(yī)藥基因工程2.反義DNA反義DNA的定義:也稱反義寡核苷酸或反義脫氧核苷酸,是一種人工合成的,能與mRNA互補(bǔ)的,用于抑制翻譯的短小反義核酸分子。反義DNA與mRNA結(jié)合后還可以誘導(dǎo)RNaseH的產(chǎn)生,降解DNA-RNA復(fù)合物中的RNA,從而大大縮短了mRNA的半衰期。反義RNA可以通過自動合成儀,但其很易被降解,為提高其穩(wěn)定性,親和力,降解靶核酸的能力以及其他性能,由此催生了第一代反義核酸藥物硫代磷酸脫氧寡核苷酸(PS-ODN)。第一個反義核酸藥物福米韋生就是PS-ODN藥物,由21個硫代磷酸脫氧核苷酸組成,核苷酸序列為5‘-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’,具有強(qiáng)大的抗病毒作用。18醫(yī)藥基因工程3.肽核酸肽核酸是以肽鏈骨架代替核糖-磷酸骨架的DNA類似物,是通過計算機(jī)模擬設(shè)計出來的新核酸類似物。以2-氨基乙基甘氨酸為骨架,4種堿基為側(cè)鏈,堿基通過亞甲碳基與骨架相連,保持與天然核酸中相鄰堿基以及堿基與骨架間相近的鍵數(shù)目,相鄰堿基間間隔6個鍵,堿基與骨架間為2~3個鍵。肽核酸保留了與互補(bǔ)DNA或RNA雜交的性能,親和力得到進(jìn)一步提高,同時,其化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性更強(qiáng),不易被核酸酶和蛋白酶降解;從化學(xué)角度看,更易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。18醫(yī)藥基因工程4.核酶核酶是一類具有催化活性的RNA分子,具有核苷酸水解活性,可特異性剪切RNA分子,相當(dāng)于RNA酶。核酶可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá),在RNA的自我裂解,自我剪切,tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工等過程中起重要作用。可用于藥物的開發(fā),抑制特定基因的表達(dá)。核酶具有特定的催化域和底物結(jié)合域。底物結(jié)合域可通過堿基互補(bǔ)與靶序列結(jié)合,相當(dāng)于反義RNA;而催化域可在特定位點剪切目的RNA。通過改變結(jié)合域的序列,核酶可切割特定序列的mRNA。核酶用作藥物的一個優(yōu)點是不易引起動物或人的免疫反應(yīng)。具有催化活性的脫氧核酶(DNAzyme),是通過合成隨機(jī)寡核苷酸庫,從中篩選到一個具有核酶活性的寡核苷酸。該寡核苷酸含一個由15個核苷酸組成的催化域,兩側(cè)是7~8個核苷酸的臂,與目標(biāo)RNA互補(bǔ)配對。針對不同目的基因的脫氧核酶已經(jīng)在體外和體內(nèi)發(fā)生了酶學(xué)反應(yīng)。18醫(yī)藥基因工程二.核酸疫苗1.核酸疫苗的工作方式核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗,是利用基因重組技術(shù)將編碼抗原的基因裝入載體,然后直接導(dǎo)入動物體內(nèi),通過機(jī)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成蛋白,產(chǎn)生的蛋白作為抗原誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答,即通過細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體,從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。2.疫苗載體核酸疫苗是通過疫苗載體將抗原編碼基因?qū)霗C(jī)體而激發(fā)免疫的。導(dǎo)入方式有⑴裸DNA直接注射到肌肉內(nèi);⑵用脂質(zhì)體包裹DNA后在注射;⑶將DNA用基因槍注入體內(nèi);⑷通過去毒的內(nèi)生細(xì)菌引導(dǎo)DNA進(jìn)入體內(nèi)。疫苗載體是一種穿梭質(zhì)粒載體,含有真核表達(dá)系統(tǒng)的啟動子,以及用于真核細(xì)胞的選擇標(biāo)記;用于動物實驗的載體還含有在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的病毒復(fù)制區(qū);為提高疫苗的免疫原性,載體中還加入具有強(qiáng)烈佐劑作用的CG序列。典型的核酸疫苗載體有pcDNA3.1,以及在此基礎(chǔ)上去掉病毒復(fù)制單位并用于雙宿主可用的卡那霉素抗性基因替換氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗體基因的改建載體pVAX1。(圖18-6)
18醫(yī)藥基因工程3.核酸疫苗的特點優(yōu)點:⑴安全性好,沒有感染的危險;⑵免疫效果好,核酸疫苗能在自身細(xì)胞中產(chǎn)生于自然抗原接近的外源性蛋白,能誘導(dǎo)產(chǎn)生類似自然抗原的免疫應(yīng)答;⑶制備簡單,只需對編碼抗原的基因進(jìn)行克?。虎群怂嵋呙绲谋举|(zhì)是核酸分子,因而不同于蛋白質(zhì)和活疫苗,可以在室溫條件下保存,不存在疫苗的冷藏和低溫運(yùn)輸問題,從而保證DNA疫苗的高效接種率;⑸免疫應(yīng)答持久,外源基因的不斷表達(dá)可持續(xù)提供抗原。18醫(yī)藥基因工程三.RNA干擾1.RNA干擾現(xiàn)象
RAN干擾(RNAi)是指對應(yīng)于某種mRNA的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)分子使mRNA發(fā)生特異性降解,導(dǎo)致其不能表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)現(xiàn)象。
RNAi發(fā)揮作用包括兩個階段:
⑴起始階段:雙鏈RNA分子進(jìn)入細(xì)胞后被稱為Dicer的核酸酶切割為21~23個核苷酸長的小分子干擾RNA片段(siRNA)。Dicer核酸酶屬于RNaseⅢ家族,能夠特異識別雙鏈RNA,產(chǎn)生的小片段RNA的3‘端都有2個突出堿基。然后雙鏈siRAN與核酸酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)。⑵效應(yīng)階段:siRAN打開雙鏈從而激活RISC,激活的RISC通過堿基配對與對應(yīng)的mRNA結(jié)合,并在距離siRAN3’端12個堿基的位置切割mRNA。同時,siRAN可作為引物并以mRAN為摸板合成新的dsRNA;這樣又進(jìn)入上述循環(huán),繼續(xù)對
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