酶免檢測技術原理及影響

酶免檢測技術原理及影響因素檢驗科

1.3月18日免疫室差錯問題分析及整改措施3月18日免疫室出現(xiàn)了標本漏檢問題，導致病人情緒不滿，甚至大吵大鬧，給科室形象造成了一定的影響。暴露出了免疫室一些問題，如嚴格按檢測流程執(zhí)行力度問題，認真細心問題等，同時也違背了免疫室規(guī)定的檢驗報告結果時效性原則和以病人為中心的服務宗旨。針對上述事件，經免疫室人員討論、分析，制定出以下整改措施：1、端正態(tài)度、要認真、負責2、嚴格執(zhí)行免疫室檢驗流程，仔細核對標本，不同批次檢測標本標記清楚3、增加人員緩解緊張工作狀態(tài)4、歡迎大家給出寶貴建議5、堅持免疫室兩個原則2.免疫室簡介檢驗項目普免術前四項（普免）術前四項（急篩復查）體檢AFPCEA體檢HAV(IgM)HEV(IgM、IgG)HBcAbTAP化學發(fā)光腫瘤性激素HCG貧血三項胰島素C-肽自身免疫自免肝四項ENA譜抗核抗體抗線粒體抗體血管炎過敏原呼吸道HIV初篩實驗室迎檢任務前景展望檢測方面：免疫球蛋白、補體、免疫細胞、細胞因子、免疫移植等，技術方面：電泳技術、細胞技術、分子生物學技術、流式細胞技等教學方面：華信臨床檢驗技術專業(yè)3.免疫室簡介

工作人員姓名職稱職務職責狀態(tài)孫文鮮主管檢驗技師常規(guī)免疫免疫室組長固定人員劉麗娜主管檢驗技師發(fā)光免疫免疫室質控管理員固定人員史可檢驗師自身免疫免疫室生物安全及感染控制管理員固定人員馮凡檢驗員常規(guī)免疫免疫室儀器維護及信息管理員固定人員夜班人員科室骨干科室骨干科室骨干暫時固定堅持兩個原則：1、堅持檢驗結果的準確性、及時性、有效性2、堅持以病人為中心，全心全心全意服務病人4.免疫室簡介免疫室日常工作量（3月23日為例）項目標本量（人份）項目包括內容備注普篩88門診、病房普篩，乙肝五項（酶免法）急篩復查47所有急篩（酶免法）發(fā)光51腫瘤、性激素、貧血三項、胰島素、C-肽、HCG體檢37AFP、CEA、乙肝五項、丙肝、普篩自免3自身免疫、呼吸道、過敏原、雜項9TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、HBcAb-IgM總計2345.免疫室簡介免疫室特殊項目檢測成本項目成本（％）項目成本（％）項目成本（％）項目成本（％）備注AFP66.29FSH66.29Ferr52.51呼吸道63.98CEA66.29LH66.29Foll89.97過敏原69.63CA15374.76P66.29B1290.05抗核抗體66.60CA19985.59T66.29胰島素67.94抗ds-DNA158.20CA12585.59PRL66.29C-肽62.20抗平滑肌抗體69.69FPSA85.59E266.29自免肝55.02ENA譜57.50TPSA85.59HCG66.29血管炎61.70抗線粒體抗體待定注：此統(tǒng)計結果可信度為95％6.一、抗原抗體反應二、酶免疫技術的分類、原理及特點三、酶聯(lián)免疫吸附試驗四、ELISA法檢測注意事項五、ELISA法檢測常見問題及解決方法7.一、抗原抗體反應8.抗原抗體反應原理抗原抗體結合反應是抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)在化學結構和空間結構上具有互補性，使抗原表位嵌入抗體超變區(qū)的槽溝，發(fā)生特異性結合，其關系如鑰匙和鎖。有四種分子間作用力參與并促使抗原、抗體的結合。9.抗原抗體反應原理氫鍵結合力范德華引力靜電引力疏水作用力抗原抗體結合力10.抗原抗體反應特點及影響因素抗原抗體反應特點：1、特異性2、比例性

3、可逆性抗原抗體反應影響因素：1、反應物自身因素：抗原抗體2、反應環(huán)境條件：電解質酸堿度溫度抗原抗體反應影響因素：1、反應物自身因素：抗原理化性狀、表位種類、數(shù)目抗體來源、特異性、親和性、效價2、反應環(huán)境條件：電解質8·5g/LNaCl溶液

酸堿度pH6--9為宜溫度最適溫度為37℃11.二、酶免疫技術的分類、特點及原理12.1、酶免技術的分類.酶免疫技術酶免疫組化組織切片或其它標本中抗原的定位

酶免疫測定液體標本中抗原或抗體的定性和定量均相

異相固相酶免疫測定液相酶免疫測定1、酶放大免疫測定技術EMIT2、克隆酶供體免疫分析CEDIA分離結合、游離酶標記物，底物測定檢測微量短肽激素、小分子抗原最廣泛，酶聯(lián)免疫吸附試驗小分子激素、半抗原測定13.

酶免技術的分類2、酶免技術特點抗原抗體反應的特異性+酶高效催化反應的專一性主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶標物特點：

免疫學活性酶對底物的催化活性14.3、酶免技術原理及特點原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應酶對底物的顯色反應對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。15.二、酶聯(lián)免疫吸附試驗16.1、基本原理.原理包被12反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體3洗滌使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離4底物顯色定性或定量的分析三個必要試劑

固相的抗原或抗體

酶標記物（酶結合物）

酶反應的底物

17..雙抗體夾心法（測抗原）方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應用：二價或二價以上的較大分子抗原測定

HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等.2、方法類型及反應原理18.方法類型及反應原理雙位點一步法（測抗原）方法：用單克隆抗體做成固相抗體和酶標抗體，待測抗原酶標抗原同時加入，加底物顯色應用：與雙抗體夾心法相似，提高了特異性、靈敏度，需注意“鉤狀效應”19.競爭法（測抗原）

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。

應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）方法類型及反應原理20..雙抗原夾心法（測抗體）原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應用：乙型肝炎表面抗體方法類型及反應原理21.方法類型及反應原理間接法（測抗體）方法用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定22.方法類型及反應原理競爭法（測抗體）原理：類似檢測抗原的競爭法應用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測23.方法類型及反應原理捕獲法（測抗體）

應用：病原體急性感染診斷中的IgM型抗體甲型肝炎HAV-IgM抗體乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體24.四、ELISA法檢測注意事項25.1、標本避免溶血、高脂血、纖維蛋白凝塊盡量新鮮，避免細菌污染一般5天內檢測的血清可4℃保存，否則低溫保存。

26.

2、試劑.試劑盒保存于2-8℃.使用前應先將檢測試劑盒放置室溫平衡15-30分鐘，保證酶等液體的初始反應溫度及活性劑的溶解。.觀察外包裝和內組份有無漏液。27.

3、加樣

A.加樣不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可濺出；D.避免產生氣泡；E.盡可能使用同一加樣器，裝緊槍頭，加樣后充分混勻。加樣器定期校準！28.溫育溫度的選擇足夠的反應時間“邊緣效應”的排除4、溫育29.5、洗板

按說明書洗板次數(shù)防止洗板機堵孔有適當?shù)那峙輹r間每孔加入洗液>350ul

不溢孔，殘留<5ul洗板后拍干，封板紙

不能重復使用

30.

6、顯色檢查底物溶液的有效性；試劑顯色時先加A液，后加B液，二者不要顛倒。前后加入的間隔時間不超過10分鐘，不漏加。A、B液應避免接觸污染物。不同廠家、批次酶顯色液不得混用31.

7、終止和讀數(shù)肉眼判斷不準確，影響結果酶標儀的波長選擇的問題。加完終止液后30分鐘內讀取數(shù)據(jù)。保證酶標板的底部是清潔干燥的。酶標儀臨界值計算公式的設定32.8、結果判讀

項目CUTOFF陽性判斷HIV（科華）0.1×MIN（PCx，2.5)>cutHIV（麗珠）0.15+MAX(NCx,0.08)>cut灰區(qū)又稱灰色帶反應。就是把OD值在Cutoff值正負20%這個范圍內的標本稱為灰區(qū)標本。這個范圍稱為灰區(qū)。.灰區(qū)是客觀存在的，沒有不存在灰區(qū)的試劑，我們只是盡量減少灰區(qū)的出現(xiàn)比例。.減少灰區(qū)最有效的方法就是盡量將板洗滌干凈。不同試劑盒，CUTOFF值計算方法不同例：33.五、ELISA法檢測常見問題及解決方法34.ELISA實驗常見問題及解決方法類風濕因子：一般為IgM型，可與變性IgGFc段非特異結合，因此可能與包被的IgG以及隨后加入的酶標IgG結合而產生假陽性。補體：包被抗體及隨后加入的酶標抗體均能激活補體而與補體C1q位點結合而產生假陽性，也可降低檢測物與固相結合而引起假陰性或測值偏低異嗜性抗體：人血清中含有抗齒類動物（羊、鼠等）Ig的抗體，即天然異嗜性抗體。與酶標二抗出現(xiàn)假陽性。溶菌酶：可與等電點5的低等電點蛋白強結合，雙抗體夾心法ELISA可假陽性。溶血：Hb中的血紅素集團有類似過氧化物的活性，溫育時吸附固相可與HRP顯色。細菌污染：細菌分泌的一些酶可對抗原抗體蛋白分解或直接影響酶標抗體作用，并且細菌引起標本混濁。標本4℃存放過久：IgG聚合成二聚體，間接法中易假陽性。建議<1周標本凝固不全：殘留纖維蛋白原形成的纖維蛋白塊，造成假陽性。內源性標本因素：外源性標本因素：35.現(xiàn)象可能原因解決方法顯色淡靈敏度低1、試劑盒未平衡至室溫實驗前試劑盒置于室溫平衡30分鐘以上2、水浴箱溫度不到37℃調整水浴箱溫度至37℃孵育期間不宜多開門3、孵育時間不夠校準定時鐘、準確定時4、樣品加樣量偏少校準吸液器吸嘴與移液器接合緊密吸嘴一次性使用5、酶結合物加樣量偏少瓶身應垂直滴加，保證液滴最大6、底物作用時間不夠延長至標準時間7、樣品用疊氮鈉防腐，抑制了酶活性與酶一同加入的樣品中不能用NaN3防腐8、蒸餾水被污染換用合格蒸餾水或去離子水9、洗滌液配置不當，稀釋倍數(shù)>1:20準確配置洗滌液10、試劑盒運輸時間太長，受高溫影響夏天長途運輸時，縮短時間，低溫措施11、試劑盒失效不適用失效試劑36.現(xiàn)象可能原因解決方法重復性差1、樣品數(shù)量較多、加樣時間過長重復測定標本時，盡可能使用同一移液器，裝緊吸嘴，條件、人員應盡量與上次保持一致，以排除這些因素造成的重復性差的可能性。2、加樣量不一致3、孵育時間不一致4、洗滌條件不同5、操作人員不同滿板白，陽性對照不顯色1、把終止液誤當作酶結合物、或底物使用嚴格按試劑說明書操作，加液時看準標簽，正確稀釋洗滌液，不要漏加試劑2、漏加試劑，如酶結合物、底物A、B液3、蒸餾水被污染，或盛洗滌液桶被污染，留有使酶失活的物質，換用合格水盛蒸餾水的瓶子要潔凈37.現(xiàn)象可能原因解決方法滿板