結核分枝桿菌診斷技術的發(fā)展及目前臨床應用的新型診斷技術產品分析

結核分枝桿菌診斷技術的發(fā)展及目前臨床應用的新型診斷技術產品分析快速準確地診斷出結核分枝桿菌感染是控制和治療結核病的前提和關鍵。多年來，結核桿菌的診斷技術在不斷地發(fā)展和創(chuàng)新，近年來，一些針對結核桿菌檢測的新方法陸續(xù)被報道，一些新型的診斷技術產品也陸續(xù)上市。本資料綜述了結核桿菌的主要診斷方法，并對目前國際市場上廣泛應用的商業(yè)化診斷技術產品進行了簡要分析。標簽：結核分枝桿菌；診斷技術；分析AdvanceindiagnosistechniquesofMycobacteriumtuberculosisandanalysisofnewdiagnostictechnologiesandproductsinclinicalapplicationFENG?Meimei1??SU?Wenqin21.HaikouVTIBiologicalInstitute,Haikou570311,China;2.DepartmentofPharmacy,HainanMedicalCollege,Haikou571199,China[Abstract]FastandaccuratediagnosisofMycobacteriumtuberculosisinfectionisthekeyandprerequisitetocontrolandtreatmenttuberculosis.Formanyyears,thediagnostictechniquesofMycobacteriumtuberculosishavebeendevelopingandinnovating.Inrecentyears,somenewtechniquesforMycobacteriumtuberculosisdetectionwerereportedandsomenewdiagnosticproductshavebeenlisted.ThispaperreviewedthemaindiagnosistechniquesofMycobacteriumtuberculosis,andanalysedbrieflythecommercializeddiagnosticproductswhichareusedwidelyintheinternationalmarketnow.[Keywords]Mycobacteriumtuberculosis;Diagnosis;Analysis結核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）是引起結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺結核最多見。據WHO統(tǒng)計，目前全球有1/3約20億人被感染，每年新增結核病感染者約800萬，至少有300萬人死于該病。因此，要有效地控制和治療結核病，準確的診斷是前提和關鍵，只有準確、快速地檢測出結核分枝桿菌的感染或感染的狀態(tài)，才能為臨床對癥治療提供依據。盡管結核分枝桿菌的診斷技術在不斷地發(fā)展，檢測方法和診斷產品很多，但各有缺點或不足，難以完全滿足臨床檢測的需求，因此，新型結核桿菌診斷技術及產品的研發(fā)勢在必行。1?結核分枝桿菌診斷技術的發(fā)展1.1?細菌學檢測結核病的細菌學檢測是目前唯一確診結核病的方法，主要有痰涂片法和培養(yǎng)法。近年來，盡管結核病的診斷技術在不斷地創(chuàng)新，但細菌學檢驗法在結核病的診療中仍然占有很重要的位置。1.1.1?痰涂片法?痰涂片是應用歷史最久，也是臨床最常見細菌學方法，是發(fā)現肺結核傳染源的直接手段。主要有抗酸染色法、熒光染色法和聯(lián)染法，涂片具有快速、簡便、價廉等特點，但靈敏度低、特異性差，對早期非排菌感染者的診斷不適用，且診斷結果易受實驗室客觀條件的影響。1.1.2?培養(yǎng)法?該方法是通過在培養(yǎng)基上對樣本培養(yǎng)，然后根據結核分枝桿菌初生長的時間、菌落形態(tài)以及是否產色素等特點，加以診斷，是目前檢測結核分枝桿菌的“金標準”，在結核病細菌學診斷方面具有決定性的意義。缺點是周期長，檢驗結果嚴重滯后診斷，難以滿足臨床需要。1.2?免疫學方法1.2.1?結核菌素試驗?結核菌素試驗，也稱PPD試驗，是一種傳統(tǒng)的結核病診斷試驗，用一定濃度的結核菌素注射到待檢者前臂掌側皮內，48～72h后根據注射部位有無硬節(jié)，及硬節(jié)大小作為結果的判斷標準，主要用作結核病的輔助診斷、卡介苗接種效果以及細胞介導的免疫應答反應的檢測。反應的出現主要是細胞免疫參與反應，但也有體液免疫參與。該法目前仍在許多國家使用，缺點是假陽性率高、不易標準化。1.2.2?免疫血清學檢測?人體感染結核分枝桿菌后，會產生一系列體液免疫和細胞免疫反應，并明顯表現為體液免疫與細胞免疫分離的現象[1]。體液免疫的作用方式是通過效應B細胞分泌抗體，并與相應抗原發(fā)生特異性結合來清除抗原，而細胞免疫則是通過效應T細胞分泌細胞因子使靶細胞溶解死亡。結核桿菌的體液免疫檢測既可用已知的結核抗原來測定未知的結核抗體，也可用已知的結核抗體來測定未知的結核抗原，此外，還可以檢測免疫復合物。因此，基于體液免疫檢測的種類有檢測結核抗體、檢測結核抗原、檢測免疫復合物?；诩毎庖叻磻脑\斷技術是診斷結核分枝桿菌感染的新方向，這種技術的產生得益于結核分枝桿菌基因組學和免疫學診斷技術的發(fā)展。其基本原理為，機體被結核桿菌感染后，存在于體內的記憶性T細胞會對體外特異性抗原的刺激做出積極反應，表現為特定細胞因子的釋放和細胞因子譜的變化。通過對這些細胞因子進行定量分析，達到診斷結核感染狀態(tài)的目的。這一技術正在結核相關疾病的診斷中顯示出其特有的優(yōu)勢，已成為國際上關注的熱點，有可能在結核防控領域產生革命性的變革。因為該技術具有高敏感性和高特異性，并且不受卡介苗和大多數非致病分枝桿菌的影響。目前該技術已經在健康人中潛伏性感染風險的評估、免疫抑制人群中潛伏性感染的診斷、免疫治療前結核桿菌感染的篩查、活動性結核和潛伏性結核的鑒別診斷、活動性結核發(fā)病風險預測等臨床領域表現出潛在的應用價值，并具有巨大的市場潛力。目前，應用到臨床檢測的是γ-干擾素釋放分析技術（interferongammareleaseassay，IGRA），該技術是對全血或單核細胞在結核桿菌特異性抗原刺激后產生的γ-干擾素進行檢測，因為受到抗原刺激而致敏的T細胞再次遇到同類抗原時能產生γ-干擾素，因此可以判斷機體是否存在潛伏結核感染。無論是基于體液免疫反應的檢測還是細胞免疫反應的檢測，所使用的檢測方法基本相同，主要有以下幾種。1.2.2.1?酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）?該法是利用抗原與抗體可進行特異性反應的原理，進行定量檢測的方法，該法1974年建立。1976年Nassau等首先將ELISA用于血清結核抗體的檢測。根據檢測原理的不同，可將ELISA分為間接法、夾心法和競爭法3類，是目前較為成熟的血清學輔助診斷方法。但該法會因觀察對象、檢測抗原的不同質控等因素，結果差異較大[2]。1.2.2.2?免疫印跡技術?免疫印跡技術，是Southern等于1975年建立的一種特異性抗原、抗體檢測技術，是SDS技術與高敏感性的酶聯(lián)免疫技術相結合的產物。1986年CoatesSR等[3]首先將免疫印跡技術用于結核病人血清抗體水平的檢測，結果表明本法對活動性結核病人的診斷具有很高的價值。1.2.2.3?酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）?20世紀80年代中期，SedgwickJD等[4]和CzerkinskyCA等[5]根據ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術（enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT）。該技術可以在單細胞水平上進行細胞因子的檢測，對結核病的早期診斷意義重大。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，且客觀、易操作、易自動化。如果能區(qū)分潛伏和活性感染，將具有更高的臨床應用價值，但缺點是所用儀器和試劑較昂貴。1.2.2.4?金標免疫斑點法?該技術是20世紀80年代中后期發(fā)展的一種新型免疫學標記和檢測技術，九十年代起在結核病血清學診斷中得以應用。免疫金標技術是在免疫斑點檢測原理的基礎上用膠體金標記替代了酶標記，可以用于定性或半定量檢測，由于該法操作簡便、快速，并可單人份檢測，因此深受歡迎。缺點是不能定量，敏感性和特異性低。1.3?分子生物學方法隨著分子生物學的飛速發(fā)展，其在結核病領域的研究和應用也逐漸深入。結核病的基因診斷、耐藥性測定、菌種的分子生物學鑒定等均取得了重大進展。目前，研究、應用報道較多的方法主要有如下幾種。1.3.1?核酸探針法?核酸探針法的基本原理是利用已知的核酸探針檢測結核分枝桿菌核酸樣品中的特定基因序列。核酸探針是一項很有前途的檢測技術，它可以鑒定不同種群的分枝桿菌，有助于結核病的鑒別診斷。其顯著優(yōu)點是特異性強[6]，缺點是直接檢測臨床標本的敏感性較低，因此，目前核酸探針法很少用于臨床診斷。1.3.2?PCR技術?1989年HanceAJ等[7]首先將PCR用于結核分支桿菌的檢測。PCR是一項良好的實驗研究技術，具有快速、靈敏度高、特異性強、重復性好、可自動化、通量化等特點，這對于因排菌量少或因結核桿菌發(fā)生L型變異，常規(guī)細菌學方法不易診斷的患者，鑒別診斷及化療后排菌情況的觀察，具有很高的臨床診斷價值。但常規(guī)PCR易引起產物交叉污染，結果出現假陽性。為克服PCR檢測技術的不足，近年來科研人員對其進行不斷創(chuàng)新和發(fā)展，新的PCR及其衍生技術不斷被建立，如2007年，AgacayakA等[8]研究報道的PCR-RFLP（聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析）；1993年，HiguchiR等[9]報告提出了Real-TimePCR（實時定量熒光PCR），2008年，TakahashiT等[10-11]研究報道的定量巢氏PCR方法等。此外，還有PCR-SSCP技術、PCR-反向斑點雜交技術、PCR-基因芯片分析法、RNA/RNA錯配法、分子燈塔法（molecularbeacon）、PCR-雙脫氧指紋圖譜（PCR-ddF）等。盡管該技術具有很多優(yōu)點，但在臨床檢測中如果操作不慎，易出現假陽性和假陰性結果，不能區(qū)分死菌與活菌。1.3.3?DNA序列測定?DNA序列測定，是用PCR的方法擴增待測基因，測序后與其標準株的同一片段進行比對。DNA測序是菌種鑒定和檢測基因突變的“金標準”，不僅能夠用于突變的檢測，而且能夠確定突變的部位與性質。但該法操作繁瑣，費用昂貴，因此限制了它的臨床推廣應用，目前多用于評價其他檢測方法的參考方法或與其他方法結合應用。1.3.4?基因芯片技術?基因芯片始創(chuàng)于90年代初，又稱DNA芯片，是近年發(fā)展起來的進行大規(guī)模遺傳多態(tài)性檢測的新方法，是目前分子生物學最前沿的方法。系指將多種探針固定在基片上，與待檢標本中標記的DNA或RNA進行分子雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，進而獲取樣品分子的數量和序列信息。1999年TroeschA等[12]開發(fā)出首塊結核病相關芯片。該技術在基因分析時具有快速、準確、高通量、高信息量的優(yōu)勢，在結核分枝桿菌診斷、菌種鑒定、、耐藥性分析等方面發(fā)揮著重要的作用，但由于儀器昂貴和制備芯片成本偏高因素等限制了其在臨床診斷中的廣泛應用。1.3.5?環(huán)介導等溫擴增技術?2000年日本學者NotomiT等[13]建立了一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術，即環(huán)介導的等溫擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）。該技術依賴于自動循環(huán)的鏈置換反應，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，結果的檢測也很簡單，通過肉眼觀察即可判斷，而且特異性強、靈敏度高，適合基層快速診斷。受到了WHO、各國學者和相關政府部門的關注，短短幾年，該技術已成功地應用于多種病菌的檢測中，包括結核桿菌的檢測，目前已有相關的檢測產品上市，有望成為臨床上常規(guī)的檢測技術。1.4?噬菌體裂解技術盡管1947年Gardner就分離出了分枝桿菌噬菌體，但用噬菌體裂解法檢測結核分枝桿菌還是一個新的領域，該技術的基本原理是：分枝桿菌噬菌體只能感染活的結核分枝桿菌，該噬菌體與待檢樣品混合孵育后，侵入活的結核分枝桿菌體內，隨后加入殺毒劑殺死培養(yǎng)基內所有游離的噬菌體，而侵入結核分枝桿菌內的噬菌體大量繁殖，并裂解菌體釋放出來，釋放出來的噬菌體可感染和裂解隨后加入的指示菌（恥垢分枝桿菌），在培養(yǎng)基上形成噬菌斑，由此只需根據培養(yǎng)基上的噬菌斑的有無，就可判斷標本中是否存在活的結核分枝桿菌[14]，而且噬菌斑的數目與結核分枝桿菌的數量成正比。該法可鑒別死、活菌，特別是在結核桿菌藥敏感實驗方面另辟蹊徑。且該方法簡單、易操作、儀器設備要求低、成本低廉，易于推廣。2?目前臨床應用的新型診斷技術產品分析隨著科技的發(fā)展和學科間的交叉應用，世界各國相關領域的科研工作者們在不斷地探索，使得結核桿菌的診斷方法得到了不斷的改進和創(chuàng)新，許多性能更好、更加方便臨床應用的新型結核桿菌診斷技術和產品逐漸上市[15-17]。WHO和FDA也逐步認可了一些性價比較好、且已廣泛應用的商業(yè)化診斷技術產品，如基于液體培養(yǎng)法的由法國生物梅里埃公司研制的BacT/Alert3D檢測系統(tǒng)、美國BD公司研制的BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)、基于核酸分子擴增技術的由瑞士Roche公司研發(fā)的AmplicorMTB試劑盒、美國芝加哥Abbott實驗室開發(fā)出半自動商品化LCR診斷試劑盒、美國Gene-Trak公司研制的全自動QB復制酶擴增包裝試劑盒、美國Gen-Probe公司發(fā)展起來的Gen-Probe結核分枝桿菌檢測分析系統(tǒng)AMTDT、美國BD公司的BDProbeTecSDA系統(tǒng)、美國Cepheid公司依據熒光定量PCR的原理開發(fā)的XpertMTB/RIF系統(tǒng)、澳大利亞ICT公司基于免疫色譜技術的CapiliaTB試劑盒研發(fā)的ICT-TB測試卡；英國OxfordImmunotec公司基于細胞免疫反應的γ-干擾素釋放分析技術生產T-SPOT.TB試劑盒和澳大利亞Cellestis公司研發(fā)的QuantiFERON-TBGold、日本榮研公司與FIND合作基于LAMP技術研發(fā)的肺結核LAMP診斷試劑盒，還有基于噬菌體裂解技術由英國BiotecLaboratoriesLtd公司研發(fā)生產的FASTPlaqueTBTM試劑盒。目前國內通過國家食品藥品監(jiān)督管理局批準上市的結核分枝桿菌診斷試劑盒產品有40多個，這些產品的檢測方法主要集中在酶聯(lián)免疫法、PCR法、膠體金法、基因芯片法等，2011年，國內首款基于γ-干擾素釋放分析技術的試劑盒產品也正式上市。3?結論由于結核分枝桿菌染色體變異的多樣性和多耐藥結核桿菌的出現，有時用一種方法難以檢測或鑒定出所感染的菌株，因此還需要揚長避短，幾種方法聯(lián)合使用。此外，目前尚無一種診斷技術或產品可嚴格區(qū)分出潛伏性感染和活動性結核，因此更敏感、更快捷、可區(qū)分潛伏感染和活動性結核的新型診斷技術或產品的研發(fā)，仍然任重道遠。[參考文獻][1]張本，王忠仁，宋禮章.中華醫(yī)學會第九次全國結核病學術會議紀要[J].中華結核和呼吸雜志，1996，19（6）：375-376.[2]中華結核和呼吸雜志編輯委員會.抗結核抗原的IgG抗體測定（ELISA）在肺結核診斷上的價值[J].中華結核和呼吸雜志，1998，21（4）：222-223.[3]CoatesSR，HansenD，SchecterG，etal.IdentificationofMycobacteriumtuberculosisantigensinSeibertfractionsbyImmunoblotting[J].JClinMicrobiol，1986，24（1）∶126-130.[4]SedgwickJD，HoltPG.Asolid-phaseimmunoenzymatictechniqueforenumerationofspecificantibodysecretingcells[J].JImmnuolMethods，1983（57）：301.[5]CzerkinskyC.Asolid-phaseenzyme-linkedimmunospot(ELISPOT)assayforenumerationofspecificantibody-secretingcells[J].JImmuoolMethods，1983（65）：109.[6]LebrunL，EspinasseF，PovedaJD，etal.EvaluationofnonradioactiveDNAprobesforidentificationofmycobacteria[J].JClinMicrobiol，1992（30）：2476-2478.[7]HanceAJ，GrandchampB，Levy-FrebaultV，etal.DetectionandidentificationofmycobacteriabyamplificationofmycobacterialDNA[J].MolMicrobiol，1989（3）：843-849.[8]AgacayakA，BulutY，SeyekA.DeteetionofMycobaeteriumspeciesdistributionintheSputumsamplesoftuberculosispatientsbyPCR-RFLPmethodinElazigProvinee[J].MikrobiyolBul，2007，41（2）：203-209.[9]HiguchiR，FocklerC，DollingerG，etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions[J].Biotechnology，1993，11（9）：1026-1030.[10]TakahashiT，TamuraM，AsamiY，etal.Novelwide-rangequantitativenestedreal-timePCRassayforMyeobacteriumtubereulosisDNA:developmentandmethodology[J].JclinMiero