第10章動(dòng)物染色體工程

第10章動(dòng)物(dòngwù)染色體工程染色體工程(chromosomeengineering)是按照人們的需要對(duì)生物的染色體進(jìn)行操作,添加、削弱或替代(tìdài)染色體，從而達(dá)到定向育種或創(chuàng)造人工新物種的目的。共一百一十九頁(yè)AnimalChromosomeEngineering◆認(rèn)識(shí)(rènshi)染色體與染色體組◆什么是染色體工程◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個(gè)別染色體工程人工染色體共一百一十九頁(yè)一、認(rèn)識(shí)染色體1.染色體的組成與DNA、基因之間的關(guān)系2.染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類(fēnlèi)3.染色體DNA的3種功能元件4.染色體組共一百一十九頁(yè)1、真核細(xì)胞染色體的組成(zǔchénɡ)組蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4；非組蛋白：HMG、DNA結(jié)合蛋白DNA：不重復(fù)序列；中度重復(fù)序列；高度(gāodù)重復(fù)序列少量的RNA；共一百一十九頁(yè)2、染色體的主要結(jié)構(gòu)(jiégòu)◆著絲粒(centromere)●主縊痕(Primaryconstriction)

◆次縊痕(secondaryconstriction)◆動(dòng)粒(kinetochore)◆核仁組織區(qū)(nucleolarorganizingregion,NOR)◆隨體(satellite)◆端粒(telomere)根據(jù)著絲點(diǎn)的位置而定，可將中期(zhōngqī)染色體分為四種：中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體。共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)染色體的超微結(jié)構(gòu)核小體是染色體包裝(bāozhuāng)的基本單位；染色體包裝的螺線管模型：共一百一十九頁(yè)核小體的結(jié)構(gòu)(jiégòu)每一個(gè)核小體核心(héxīn)包含有146bpDNA和8個(gè)組蛋白分子（2H2A，2H2B，2H3，2H4）；DNA在每個(gè)組蛋白核心外纏繞約2圈共一百一十九頁(yè)染色體的串珠狀形式(xíngshì)與螺線管結(jié)構(gòu)146bpDNA的核小體核心由54bp間隔DNA連成一條串珠狀結(jié)構(gòu)；核小體螺旋形纏繞(chánrào)形成螺線管結(jié)構(gòu)，每一周螺旋含6個(gè)核小體，因此，DNA長(zhǎng)度縮短了6倍。共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)從DNA到染色體的包裝(bāozhuāng)壓縮DNA鏈核小體螺線管染色單體超螺旋壓縮(yāsuō)比例：7×6×40×5=8400（1：7）（1：6）（1：40）（1：5）共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)DNAPackaging共一百一十九頁(yè)GeneExpression共一百一十九頁(yè)3、染色體DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定遺傳(yíchuán)的功能序列◆ARS(autonomousreplicatingsequence)◆CEN(centromericsequence)

Thecentromereisaspecializedregionofthechromosomethatplaysacriticalroleinensuringthecorrectdistributionofduplicatedchromosomestodaughtercellsduringmitosis

◆TEL(telomericsequence)

Thesequencesattheendsofeukaryoticchromosomes,calledtelomeres,playcriticalrolesinchromosomereplicationandmaintenance.共一百一十九頁(yè)DNA穩(wěn)定(wěndìng)遺傳的三種功能位點(diǎn)共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)4、染色體組◆染色體組◆染色體組型◆染色體倍性體細(xì)胞中的一組非同源染色體，它們?cè)谛螒B(tài)和功能上各不相同，但是，攜帶(xiédài)著控制一種生物生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個(gè)染色體組。

染色體組型是指一個(gè)體細(xì)胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)(xíngtài)特征。

染色體倍性是指細(xì)胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。共一百一十九頁(yè)HumanmitoticchromosomesandkaryotypeChromosomepainting=multicolorFISH共一百一十九頁(yè)染色體組用符號(hào)(fúhào)“X”表示

生物體的體細(xì)胞染色體數(shù)用2n表示，無(wú)論是二倍體還是多倍體，2n只表示體細(xì)胞的染色體數(shù)，并不表示其倍性如：玉米(yùmǐ)體細(xì)胞染色體數(shù)2n=20，普通小麥體細(xì)胞染色體數(shù)2n=42，要正確表示倍性應(yīng)寫成：玉米2n=2X=20，普通小麥2n=6X=42。符號(hào)“n”和“X”的區(qū)別與聯(lián)系單倍體與一倍體含義相同嗎？共一百一十九頁(yè)AnimalChromosomeEngineering◆認(rèn)識(shí)染色體與染色體組◆什么是染色體工程(gōngchéng)◆動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個(gè)別染色體工程人工染色體共一百一十九頁(yè)騾子母馬(mǔmǎ)和公驢的后代共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)為什么騾子不能繁殖(fánzhí)后代？

馬的染色體數(shù)是64條，驢的染色體數(shù)是62條，馬的卵子染色體數(shù)是32條，驢的精子染色體數(shù)是31條，通過精卵結(jié)合發(fā)育成的新個(gè)體——騾子的染色體數(shù)是63條。騾子的染色體聯(lián)繪紊亂(wěnluàn)因此騾子的生殖細(xì)胞不能分化發(fā)育成完整的個(gè)體。

共一百一十九頁(yè)生育(shēngyù)的概率極低騾子性成熟以后，再形成精子或卵子時(shí)，每條染色體都沒有相對(duì)應(yīng)的同源染色體進(jìn)行配對(duì)，這樣每一條染色體分到哪個(gè)配子里是隨機(jī)的，在這些配子中，只有配子里的染色體完全(wánquán)來自于馬的，或來自于驢的，這樣的配子才有生育能力。

共一百一十九頁(yè)獅虎獸（liger）

雄獅和雌虎交配產(chǎn)生的后代。獅虎獸的體型比獅或虎都要大，又同時(shí)具備兩者之間的外貌特征；獅子(shīzi)與老虎相戀、懷孕的概率極低，即使在人工飼養(yǎng)的環(huán)境下，虎、獅受孕的機(jī)會(huì)也僅為1％至2％。幼獸由于先天不足等原因，成活率僅為五十萬(wàn)分之一左右。據(jù)資料顯示，目前世界上存活的獅虎獸只有20只左右。

共一百一十九頁(yè)獅虎獸（liger）

共一百一十九頁(yè)獅虎獸獅虎虎獅獸共一百一十九頁(yè)動(dòng)物(dòngwù)染色體工程染色體倍性改造(gǎizào)結(jié)構(gòu)改造人工染色體的利用共一百一十九頁(yè)10.1.1動(dòng)物(dòngwù)的多倍體育種多倍體（polyploidy）:是指體細(xì)胞中含有三個(gè)或三個(gè)以上染色體組的個(gè)體多倍體產(chǎn)生機(jī)制：通過卵細(xì)胞第二極體的保留(bǎoliú)或受精卵早期有絲分裂的抑制而實(shí)現(xiàn)共一百一十九頁(yè)10.1動(dòng)物(dòngwù)染色體倍性改造定義：染色體倍性改造工程是指有目的、有計(jì)劃(jìhuà)地增加或減少一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造動(dòng)植物新品種的一項(xiàng)染色體工程技術(shù)。主要包括多倍體育種和單倍體育種。共一百一十九頁(yè)整倍變化(biànhuà)：多倍體：細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體單倍體：細(xì)胞中含有正常體細(xì)胞的一半染色體數(shù)非整倍體變化：染色體減少：?jiǎn)误w（減1條）、缺體（減1對(duì)）染色體增加：三體（加1條）、四體（加1對(duì)）染色體代換：同種代換、異種代換共一百一十九頁(yè)染色體數(shù)變異一是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會(huì)產(chǎn)生多倍體和單倍體；另一種是染色體組內(nèi)的個(gè)別染色體數(shù)目有所增減(zēnɡjiǎn)，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱為非整倍體。共一百一十九頁(yè)染色體結(jié)構(gòu)(jiégòu)變異易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段跟另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換缺失：染色體的某一區(qū)段及帶有的基因一起丟失倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序(shùnxù)發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。共一百一十九頁(yè)染色體結(jié)構(gòu)變異染色體易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起(yīqǐ)丟失染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)。染色體重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。共一百一十九頁(yè)缺失(quēshī)：缺失一個(gè)片段。重復(fù)：某一片斷重復(fù)出現(xiàn)。倒位：片段斷裂，倒轉(zhuǎn)180度，重新(chóngxīn)連接。易位：片段斷裂，移到另一條染色體臂上。共一百一十九頁(yè)10.1.1動(dòng)物(dòngwù)的多倍體育種

1．染色體加倍技術(shù)(人工誘導(dǎo))1).化學(xué)誘導(dǎo)法

有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。a.細(xì)胞松馳(sōnɡchí)素B：能抑制肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。共一百一十九頁(yè)

b.秋水仙堿：可以抑制細(xì)胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。其它藥物：N2O、CHCIF2和聚乙二醇等。缺點(diǎn)：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時(shí)加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒有價(jià)值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實(shí)際中的應(yīng)用不及(bùjí)物理方法。共一百一十九頁(yè)2)生物學(xué)方法(fāngfǎ)生物學(xué)上主要通過雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動(dòng)物可以通過雜交產(chǎn)生，他們(tāmen)將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poeciliaformosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。例如用雌性草魚（2n＝48）與雄性三角魴（2n＝48）雜交可以獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體。異育銀鯽與興國(guó)紅鯉雜交獲得的復(fù)合四倍體，通過細(xì)胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。這種不同科、屬、種之間的遠(yuǎn)源雜交，會(huì)導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。共一百一十九頁(yè)

動(dòng)物通過雜交方法尤其是種間雜交獲得(huòdé)異源多倍體。種間雜交導(dǎo)致第二極體不排出。

草魚♀×♂三角(sānjiǎo)魴

(2n=48)(2n=48)

草魴雜種(3n=72)

共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)包括溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。⑴溫度休克法：冷休克法（0～5℃）和熱休克法（30℃）。定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。關(guān)鍵(guānjiàn)：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達(dá)到這一點(diǎn)，必須考慮溫度處理的開始時(shí)間（TA）、處理持續(xù)時(shí)間（D）和處理溫度（T）這三個(gè)因素。3).物理學(xué)方法(fāngfǎ)共一百一十九頁(yè)

目前對(duì)魚類使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報(bào)道較多。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法好，而溫水性魚類用冷休克效果較好。優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)(liánjià)、易操作，是誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。共一百一十九頁(yè)

⑵水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極體的放出或第一次卵裂來產(chǎn)生多倍體。優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)率高（一般在90％～100％）、處理時(shí)間短（3～5min），對(duì)受精卵損傷小、成活率高。缺點(diǎn)(quēdiǎn)：需要專門的設(shè)備——水壓機(jī)，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。共一百一十九頁(yè)◆Assemblyofmicrotubules●Assemblyinvitro影響(yǐngxiǎng)微管穩(wěn)定的因素共一百一十九頁(yè)2．多倍體的倍性鑒定(jiàndìng)（1）直接法1）染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍體的一個(gè)準(zhǔn)確的直接方法，但比較費(fèi)時(shí)。2）DNA含量測(cè)定：細(xì)胞DNA含量測(cè)定是倍性鑒定的另一個(gè)有效的直接方法。（2）間接(jiànjiē)法1）體積測(cè)量2）蛋白質(zhì)電泳3）生化分析共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)

核體積測(cè)量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。核體積測(cè)量法省時(shí)、簡(jiǎn)單，在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)就能進(jìn)行而廣為人們采用，但缺乏準(zhǔn)確性，亦測(cè)不出嵌合體，往往需要校正；生化(shēnɡhuà)分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。共一百一十九頁(yè)

染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準(zhǔn)確、直接方法，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)；

DNA含量測(cè)定：流式細(xì)胞儀。是較為先進(jìn)常用的方法，其測(cè)定快速準(zhǔn)確，并能測(cè)出嵌合體，但需要特殊(tèshū)的儀器設(shè)備。采用何種方法均有利有弊，進(jìn)行鑒定主要依賴于所測(cè)樣本的發(fā)育時(shí)期、實(shí)驗(yàn)要求和所具備的儀器設(shè)備條件。共一百一十九頁(yè)流式細(xì)胞儀

FlowCytometry

Flowcytometryusesanelectronicinstrumentthatpassesparticlesorcellsonebyonethroughalaserandpastsensorsthatmeasurephysicalandchemicalcharacteristicsofthoseparticlesorcells.共一百一十九頁(yè)3、優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)與缺點(diǎn)a.優(yōu)點(diǎn)多倍體育種技術(shù)方法簡(jiǎn)單、見效快，有潛在(qiánzài)的理論和應(yīng)用價(jià)值。許多誘導(dǎo)的多倍體動(dòng)物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率。種間雜種生長(zhǎng)快，可以同時(shí)具有兩個(gè)不同的種的優(yōu)良特性。利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動(dòng)物生長(zhǎng)，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時(shí)間或影響商品價(jià)值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚、昆蟲等方面已有應(yīng)用。某些多倍體動(dòng)物肉質(zhì)量、含氧量、抗病性等經(jīng)濟(jì)性狀較二倍體好。共一百一十九頁(yè)準(zhǔn)確的處理時(shí)間；誘導(dǎo)率、成活率及孵化率的提高；準(zhǔn)確可靠的倍性鑒定方法(fāngfǎ)的確定。b.缺點(diǎn)(quēdiǎn)共一百一十九頁(yè)3.人工(réngōng)誘導(dǎo)多倍體的意義

多倍體(polyploidy):

多倍體動(dòng)物(dòngwù)如兩棲類、魚類、貝類都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率水產(chǎn)養(yǎng)殖增強(qiáng)抗病能力、提高生長(zhǎng)速度共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)特點(diǎn)多倍體與二倍體相比，最顯著的特點(diǎn)是形態(tài)(xíngtài)上的巨大性。糖類、蛋白質(zhì)及其它產(chǎn)物的含量也有所提高。由于多倍體動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快、成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以可通過人工誘導(dǎo)多倍體來改善生物的經(jīng)濟(jì)性狀。共一百一十九頁(yè)三倍體triploid共一百一十九頁(yè)人工(réngōng)誘導(dǎo)三倍體的方法直接途徑，即用物理或化學(xué)的方法對(duì)受精卵進(jìn)行處理，阻礙第二極體外排。間接(jiànjiē)途徑，即首先誘導(dǎo)獲得四倍體，待四倍體個(gè)體性成熟后再與二倍體個(gè)體自然交配，獲得三倍體。共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)魚類三倍體育種(yùzhǒng)的意義

三倍體是非偶數(shù)染色體組，故阻礙(zǔài)了生殖細(xì)胞正常的減數(shù)分裂，結(jié)果導(dǎo)致性腺不能發(fā)育。不育的三倍體經(jīng)濟(jì)魚類因?yàn)闆]有性成熟階段性腺發(fā)育的能量損耗，所以有以下優(yōu)點(diǎn)：避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚肉質(zhì)量下降并延長(zhǎng)了上市時(shí)間避免了性腺發(fā)育階段的生長(zhǎng)停滯和死亡率增加縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本并可養(yǎng)成大型個(gè)體共一百一十九頁(yè)利用三倍體魚類不育性的優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)，人們可以達(dá)到這樣的目的：①獲得生長(zhǎng)速度(sùdù)較快的三倍體品種，提高魚類養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益②控制養(yǎng)殖魚類的過度繁殖和防止對(duì)天然資源的干擾共一百一十九頁(yè)湘云鯽由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(xuéyuàn)劉筠院士培育

共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)TriploidGrassCarp三倍體草魚(cǎoyú)共一百一十九頁(yè)3．動(dòng)物多倍體育種(yùzhǒng)的意義1）多數(shù)具有良好的生長(zhǎng)率2）低等動(dòng)物的種間雜交優(yōu)勢(shì)(yōushì)非常明顯3）巨大性4）育性低(四倍體可育)共一百一十九頁(yè)10.1.2動(dòng)物(dòngwù)的單倍體育種（一）、人工單性生殖（二）、人工誘導(dǎo)(yòudǎo)雌核發(fā)育的方法（三）、雌核發(fā)育的鑒定共一百一十九頁(yè)（一）、人工單性生殖1.雌核發(fā)育：（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。

同種或異種精子進(jìn)入(jìnrù)卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來自雌核，只具有母本的性狀。共一百一十九頁(yè)自然界中一些無(wú)脊椎動(dòng)物和魚類等存在。人工誘導(dǎo)：雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常(zhèngcháng)的二倍體動(dòng)物。共一百一十九頁(yè)凡雌核發(fā)育的個(gè)體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。1911年，赫特威氏就第一個(gè)成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。赫特威氏效應(yīng)指只有在適當(dāng)?shù)母咻椛?fúshè)劑量下，才能導(dǎo)致精子染色體完全失活，屆時(shí)精子雖能穿入卵內(nèi)，卻只能起到激活卵球啟動(dòng)發(fā)育的作用。共一百一十九頁(yè)抑制(yìzhì)第二極體外排抑制(yìzhì)第一次卵裂精子遺傳物質(zhì)失活共一百一十九頁(yè)Haploidembryosaregeneratedby'mock-fertilizing'eggswithUV-irradiatedsperm(whichcannotcontributegenetically),andcansurviveafewdays.Haploidscanberescuedbysuppressingformationofthepolarbodywithpressuretreatmentshortlyafterfertilization.

抑制(yìzhì)第二極體外排共一百一十九頁(yè)朱

洗

細(xì)胞學(xué)家。浙江臨海人。1931年獲法國(guó)國(guó)家博士學(xué)位。中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)生物研究所研究員、所長(zhǎng)。長(zhǎng)期從事兩棲類、魚類、家蠶等動(dòng)物卵子成熟、受精等研究。1961年使人工雌核發(fā)育的雌蟾蜍與雄蟾蜍交配，繁殖出沒有外祖父的蟾蜍，證明了單性生殖(shēngzhí)的高等動(dòng)物仍保有傳代的能力。共一百一十九頁(yè)2.雄核發(fā)育：用經(jīng)過紫外線、X線或ｒ線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育成完全為父本性狀的二倍體。定義：遺傳失活的卵子與精子結(jié)合，發(fā)育成只有父本染色體個(gè)體的一種特殊生殖(shēngzhí)方式。共一百一十九頁(yè)一、人工(réngōng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法共一百一十九頁(yè)物理方法：采用射線包括γ射線、X射線（效果較好）和紫外線（效果較差）等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活。

化學(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如甲苯胺藍(lán)、乙烯(yǐxī)尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。

顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.精子(jīngzǐ)遺傳物質(zhì)的失活共一百一十九頁(yè)阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；利用溫度、壓力或化學(xué)方法(fāngfǎ)，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細(xì)胞松馳素B、聚乙二醇處理等。2.雌核染色體數(shù)目減少(jiǎnshǎo)的阻止共一百一十九頁(yè)首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。交配后，在精核(jīnɡhé)與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細(xì)的吸管將精核(jīnɡhé)去掉。在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。共一百一十九頁(yè)二、雌核發(fā)育的鑒別(jiànbié)共一百一十九頁(yè)鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標(biāo)為依據(jù)。也可以(kěyǐ)通過細(xì)胞學(xué)的研究，如若是雌核發(fā)育，其囊胚細(xì)胞中只出現(xiàn)一套來自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。用遺傳標(biāo)志的方法來鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個(gè)體的子代應(yīng)該都是純合型；而如果是通過阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個(gè)體，則子代的情況取決于著絲點(diǎn)與基因間的距離。在著絲點(diǎn)與基因距離遠(yuǎn)離時(shí)，將明顯增加雜合型子代的比例。共一百一十九頁(yè)三、雌核發(fā)育的意義(yìyì)共一百一十九頁(yè)為生產(chǎn)單性種群提供了可能。能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體。提供某些致死突變種的生物品質(zhì)(pǐnzhì)。在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中，可人工控制性別繁殖。廣泛地用于進(jìn)行基因-著絲點(diǎn)的定位研究。可利用產(chǎn)生新的純系來篩選除去有害的等位基因。共一百一十九頁(yè)四、人工(réngōng)誘導(dǎo)雄核發(fā)育共一百一十九頁(yè)雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。雄核發(fā)育的個(gè)體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因(yuányīn)造成的。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價(jià)值，利用雄核生殖的精子可用于冷凍基因庫(kù)，保存種質(zhì)資源，對(duì)基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。共一百一十九頁(yè)第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)染色體分離(fēnlí)染色體微切割共一百一十九頁(yè)1.原理：由于熒光染料Hoechst只對(duì)A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對(duì)G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染料后，再經(jīng)激光照射，染色體就會(huì)呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出(fāchū)的熒光波長(zhǎng)輸入計(jì)算機(jī)，通過計(jì)算機(jī)控制就可將發(fā)出(fāchū)同一波長(zhǎng)的染色體收集在一起，從而實(shí)現(xiàn)染色體的分離。一、

染色體分離(fēnlí)共一百一十九頁(yè)細(xì)胞分裂同步處理染色體的熒光色素(sèsù)染色染色體分離2.染色體分離(fēnlí)的具體步驟共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm）在倒置顯微鏡下對(duì)目的基因所在染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離。顯微激光切割法：將染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)(xìtǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細(xì)胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。二、

染色體微切割(qiēgē)共一百一十九頁(yè)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)技術(shù)微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法共一百一十九頁(yè)將同特定(tèdìng)基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基因得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中一代又一代地傳遞下去。該技術(shù)稱為染色體轉(zhuǎn)移（或染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)）。微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）共一百一十九頁(yè)一、微細(xì)胞(xìbāo)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞（或微核體）：是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。供體：微細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化(jiǎnhuà)供體基因的表達(dá)、對(duì)受體細(xì)胞影響小、微核染色體穩(wěn)定共一百一十九頁(yè)微細(xì)胞(xìbāo)制備微細(xì)胞融合共一百一十九頁(yè)1.微細(xì)胞(xìbāo)的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素）阻斷供體細(xì)胞的有絲分裂，使染色體停滯在有絲分裂中期(zhōngqī)，從而在染色體周圍逐漸形成核膜而成為眾多的微核。然后在細(xì)胞松弛素B的作用下使微核逐漸突出細(xì)胞膜外。最后經(jīng)過離心獲得含有一個(gè)微核、四周有一薄層細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜界限的微細(xì)胞。共一百一十九頁(yè)2.微細(xì)胞(xìbāo)的融合制備的微細(xì)胞只能存活幾個(gè)小時(shí)，但經(jīng)融合可使其成為能夠存活的整體細(xì)胞。常采用PEG作為細(xì)胞融合劑。最好選用帶有營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志(biāozhì)的受體細(xì)胞。由于微細(xì)胞的染色體含有互補(bǔ)的原養(yǎng)型基因，微細(xì)胞與受體細(xì)胞形成的雜合細(xì)胞即可在特定的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而被篩選出來。共一百一十九頁(yè)染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一種技術(shù)。基本步驟：⑴誘發(fā)細(xì)胞同步分裂；⑵阻斷(zǔduàn)細(xì)胞分裂于中期；⑶破碎細(xì)胞；⑷離心收集中期染色體；⑸通過適當(dāng)?shù)姆诸愞D(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。二、染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)法共一百一十九頁(yè)細(xì)胞(xìbāo)同步化與染色體的分離染色體的轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞的分離與鑒定染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)的過程共一百一十九頁(yè)1.細(xì)胞(xìbāo)同步化與染色體的分離用秋水仙素及合適的酶處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞離心收集中期相細(xì)胞沉淀(chéndiàn)洗滌數(shù)次在中性緩沖液中培育用注射針噴射細(xì)胞，使染色體釋放離心收集染色體沉淀蔗糖梯度離心或用流式細(xì)胞測(cè)量?jī)x分離單條染色體共一百一十九頁(yè)2.染色體的轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)染色體可以通過細(xì)胞的吞噬作用而進(jìn)入受體細(xì)胞。一般先采用磷酸鈣和染色體一起沉淀(chéndiàn)，再用二甲基亞砜處理受體細(xì)胞，或采用卵磷脂與膽固醇制成的脂質(zhì)體將染色體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。共一百一十九頁(yè)分離：利用(lìyòng)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選鑒定：染色體組型分析同工酶分析其他方法3.導(dǎo)入基因(jīyīn)的受體細(xì)胞的分離與鑒定共一百一十九頁(yè)第五節(jié)人工(réngōng)染色體共一百一十九頁(yè)染色體要確保(quèbǎo)在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配。它需要3個(gè)關(guān)鍵序列，包括自主復(fù)制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN）和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。

共一百一十九頁(yè)將3個(gè)關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來(qǐlái)就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價(jià)值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動(dòng)物人工染色體（mammalianartificialchromosome）共一百一十九頁(yè)基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能序列，人們利用這些序列構(gòu)建載體，重組后的DNA以線性狀態(tài)存在，這樣不僅穩(wěn)定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工(réngōng)染色體。如利用從酵母染色體上分離的ARS、CEN、TEL序列構(gòu)建載體，然后用這種載體構(gòu)建的染色體即稱為酵母人工染色體。共一百一十九頁(yè)

共一百一十九頁(yè)

共一百一十九頁(yè)共一百一十九頁(yè)【復(fù)習(xí)思考題】經(jīng)常采用的人工誘導(dǎo)多倍體形成的手段有哪些？要達(dá)到實(shí)驗(yàn)條件下二倍體雌核發(fā)育目的需要解決哪些問題？選擇、判斷題：1911年，人工條件下，

第一個(gè)在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯鲁晒Φ厝斯は司尤旧w活性，導(dǎo)致精子染色體完全失活。A.赫特威氏B.沃克C.克拉克D.摩爾根多倍體的鑒定不宜采取的方法是

。A.核體積測(cè)量B.染色體計(jì)數(shù)C.血平板計(jì)數(shù)D.利用血液成分、酶的含量等進(jìn)行生化分析溫度(wēndù)休克法包括冷休克法（0～5度）和熱休克法（30度左右）兩種，即用略高于或略低于最適溫度(wēndù)的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。測(cè)定細(xì)胞核體積對(duì)細(xì)胞多倍體進(jìn)行測(cè)定屬于直接法。

共一百一十九頁(yè)10.3人工(réngōng)染色體

人工染色體酵母人工染色體細(xì)菌(xìjūn)人工染色體哺乳類人工染色體人工染色體的應(yīng)用共一百一十九頁(yè)人工(réngōng)染色體

染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定性，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配，需要3個(gè)關(guān)鍵序列：1.自主(zìzhǔ)復(fù)制DNA序列（ARS）

是DNA復(fù)制的起點(diǎn)，確保染色體能夠開始自我復(fù)制。2.著絲粒DNA序列（CEN）

確保染色體在細(xì)胞分裂時(shí)能平均分配到子細(xì)胞中。

3.端粒DNA序列（TEL）

使DNA能結(jié)束復(fù)制，確保染色體的獨(dú)立性和穩(wěn)定性。共一百一十九頁(yè)人工(réngōng)染色體

artificialchromosome

定義：人工構(gòu)建的含有(hányǒu)復(fù)制起始點(diǎn)、著絲粒和端粒三個(gè)關(guān)鍵序列