中藥生物活性測定的指導原則解讀

前言基本原則方法學驗證基本內(nèi)容中藥生物活性測定的指導原則解讀前言成分復雜多變活性成分多藥效成分不明確毒性成分不明確給質(zhì)量控制帶來了很大的挑戰(zhàn)！現(xiàn)代分析手段的大量應用中藥質(zhì)量控制水平有了巨大的飛躍中藥特點盡管中藥質(zhì)量控制水平發(fā)展很快,但仍存在一些共性問題:含量高、容易控制的成分未必是藥效成分含量過低的藥效成分又不能保證與臨床有效劑量之間的關聯(lián)性用以控制和評價中藥質(zhì)量不夠理想中藥生物活性測定的指導原則解讀前言2010版《中國藥典》修訂時增加了《中藥生物活性測定指導原則》2010版藥典一部附錄XⅧC中藥生物活性測定指導原則2015版藥典修訂時將上版藥典附錄整合為通則，并與藥用輔料單獨成卷作為四部9000指導原則9105中藥生物活性測定指導原則中藥生物活性測定的指導原則解讀前言生物活性測定法：是以藥物的生物效應為基礎，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設計，測定藥物有效性的一種方法，從而達到控制藥品質(zhì)量的作用。規(guī)范中藥生物活性測定研究，為該類實驗設計、方法學建立等過程和測定方法的適用范圍提供指導性的原則要求。本指導原則目的藥材來源廣泛、多變，制備工藝復雜，使得中藥制劑的質(zhì)量控制相對困難。多種活性成分和具有多種藥理作用，僅僅控制少數(shù)成分不能完全控制其質(zhì)量和反映臨床療效。中藥中藥生物活性測定的指導原則解讀基本原則1.符合藥理學研究的基本原則隨機Randomization對照Control重復Replication具備簡單、精確的特點，應有明確的判斷標準分組或抽樣時指按照機遇的原則進行，使各受試對象被分配到各組的機會均等，而不受主觀因素的影響。隨機化的方法有抽簽法、拋硬幣法、隨機數(shù)字表等。設置對照，排除非實驗因素的影響，消除實驗誤差，保證實驗結果的可比性和實驗結論的正確性。正常對照、模型對照、陽性對照、溶劑對照。重復是指在相同實驗條件下進行多次研究或多次觀察。重復原則包括兩個含義：①是實驗必須有足夠的樣本數(shù)或例數(shù)，在一次實驗中有充分的重復；②是要使實驗結果可靠，必須多次重復實驗。也就是說，實驗要有一定的次數(shù)。中藥生物活性測定的指導原則解讀基本原則2.體現(xiàn)中醫(yī)的特點鼓勵應用生物活性測定方法探索中藥質(zhì)量控制，擬建立的方法的測定指標應與該中藥的“功能與主治”相一致?？蓞⒖嫉乃幮W實驗模型：(1)治療心肌缺血實驗：垂體后葉致大鼠心肌缺血實驗、小鼠耐缺氧實驗；(2)解熱、鎮(zhèn)痛實驗：角叉菜膠或細菌內(nèi)毒素解熱實驗、小鼠扭體實驗；(3)止咳平喘實驗：氨水刺激實驗、離體豚鼠氣管實驗；(4)抗炎解毒實驗：小鼠耳腫脹實驗、毛細血管通透性實驗、抑菌實驗；(5)活血化瘀實驗：血小板聚集實驗、耳廓微循環(huán)實驗。中藥生物活性測定的指導原則解讀基本原則3.品種選擇合理4.方法科學可靠優(yōu)先選用生物效價測定法，不能建立生物效價測定的品種可考慮采用生物活性限值測定法，待條件成熟后可進一步研究采用生物效價測定法。詳見四部1431生物檢定統(tǒng)計法擬開展生物活性測定研究的中藥材或中成藥應功能主治明確，其中，優(yōu)先考慮治療適應癥明確單一的中藥注射劑品種，對急重癥用藥、保護品種應重點進行研究。中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容1.實驗條件實驗系括整體動物、離體器官、血清、微生物和組織、細胞、亞細胞器、受體、離子通道和酶等。燈盞花素注射液采用整體動物進行生物活性測定縮宮素采用大鼠離體子宮平滑肌進行生物活性測定水蛭用凝血酶進行生物活性測定應選擇背景資料清楚、影響因素少、檢測指標靈敏和成本低廉的試驗系統(tǒng)。應盡可能研究各種因素對試驗系的影響，采取必要的措施對影響因素進行控制。試驗系的選擇中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容實驗動物如采用實驗動物，盡可能使用小鼠和大鼠等來源多，成本低的實驗動物，并說明其種屬、品系、性別和年齡。應遵循3R原則：“優(yōu)化、減少、替代”Refinement&Reduction&ReplacementRefinement（優(yōu)化）通過改進條件，善待動物，提高動物福利，或完善實驗程序和改進實驗技術，避免或減輕給動物造成的與實驗目的無關的疼痛和緊張不安的科學方法。Reduction（減少）指在科學研究中，使用較少量的動物獲取同樣多的試驗數(shù)據(jù)或使用一定數(shù)量的地動物能獲得更多實驗數(shù)據(jù)的科學方法。Replacement（替代）指使用其他方法而不用動物所進行的試驗，以達到某一試驗目的?；蚴鞘褂脹]有知覺的試驗材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎動物進行試驗中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容適用于需大量動物的實驗，如某些藥物的篩選，半數(shù)致死量的測定。也較適用于避孕、抗炎鎮(zhèn)痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤及抗衰老等藥物的實驗。小鼠比較適用于抗炎、血壓測定、利膽、利尿等藥物實驗，也可用于進行亞急性和慢性毒性實驗。大鼠因其對組胺敏感，并易于致敏，故常用于抗過敏、平喘和抗組胺等藥物實驗。又因它對結核敏感，也用于抗結核病藥的實驗。豚鼠近交系：BALB/c、C57BL;遠交系：KM、ICR小鼠；突變系：裸鼠SD、Wistar大鼠中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容供試品選擇應選擇工藝穩(wěn)定，質(zhì)量合格的供試品。若為飲片，應基源清楚。應至少使用三批供試品生物效價測定法：首選中藥標準品，也可以考慮化學藥作為標準品生物活性限值測定法：可采用中藥成分或化學藥品作為方法可靠性驗證用對照品。標準品或?qū)φ掌凡捎脴藴势坊驅(qū)φ掌肪鶓欣碚撘罁?jù)和/或?qū)嶒炓罁?jù)。國家標準中采用的標準品或?qū)φ掌返氖褂脩蠂矣嘘P規(guī)定要求。中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容2.實驗設計設計原理所選實驗方法的原理應明確，所選擇的檢測指標應客觀、專屬性強，能夠體現(xiàn)供試品的功能與主治或藥理作用。生物效價測定法：按生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）的要求進行實驗設計研究；生物活性限值測定法：試驗設計可考慮設供試品組、陰性對照組或陽性對照組，測定方法需建立動物模型時，應考慮設置模型對照組。重現(xiàn)性好的試驗，也可以不設或僅在復試時設陽性對照組。設計類型中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容生物效價測定法：供試品和標準品均采用多劑量組試驗，并按生物檢定的要求進行合理的劑量設計，使不同劑量之間的生物效應有顯著性差異；生物活性限值測定法：建議只設一個限值劑量，限值劑量應以產(chǎn)生生物效應為宜；劑量設計給藥途徑：一般應與臨床用藥途徑一致。如采用不同的給藥途徑，應說明理由。給藥次數(shù)：根據(jù)藥效學研究合理設計給藥次數(shù)，可采用多次或單次給藥。指標選擇：應客觀、明確，與“功能主治”基本一致。其他中藥生物活性測定的指導原則解讀基本內(nèi)容3.結果與統(tǒng)計生物效價測定法：應符合生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）的要求，根據(jù)樣品測定結果的變異性決定效價范圍和可信限率（FL％）限值；生物活性限值測定法：應對誤差控制進行說明，明確試驗成立的判定依據(jù)，對結果進行定量和/或定性統(tǒng)計學分析，并說明具體的統(tǒng)計方法和選擇依據(jù)。4.判斷標準生物效價測定法：應按品種的效價范圍和可信限率（FL％）限值進行結果判斷。生物活性限值測定法：應在規(guī)定的限值劑量下判定結果，初試結果有統(tǒng)計學意義者，可判定為符合規(guī)定；初試結果沒有統(tǒng)計學意義者，可增加樣本數(shù)進行一次復試，復試時應增設陽性對照組，復試結果有統(tǒng)計學意義，判定為符合規(guī)定，否則為不符合規(guī)定。中藥生物活性測定的指導原則解讀方法學驗證1.測定方法影響因素考察應考察測定方法的各種影響因素，通過考察確定最佳的試驗條件，以保證試驗方法的專屬性和準確性。根據(jù)對影響因素考察結果，規(guī)定方法的誤差控制限值或?qū)y(tǒng)計有效性進行說明。2.精密度考察重復性按確定的測定方法，用3批供試品、每批3次或同批供試品進行6次測定試驗后對結果進行評價。生物活性測定試驗結果判斷應基本一致。中間精密度考察實驗室內(nèi)部條件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日和實驗時間）對測定結果的影響，至少應對同實驗室改變?nèi)藛T進行考察。重現(xiàn)性生物活性測定試驗結果必須在3家以上實驗室能夠重現(xiàn)。3.方法適用性考察按擬采用的生物活性測定方法和劑量對10批以上該產(chǎn)品進行測定，以積累數(shù)據(jù)，考察質(zhì)量標準中該測定項目的適用性。中藥生物活性測定的指導原則解讀例：舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測定法藥材選擇：舒血寧注射液功能主治：擴張血管，改善微循環(huán)。方法：生物效價測定法模型選擇：血小板聚集抑制模型動物：家兔供試品：

舒血寧注射液(5mL/支)對照品：金納多注射液(5mL/支)試驗方法：家兔頸總動脈放血75mL，加3.8％枸櫞酸納(1:9)抗凝，1000r/min離心10min制備富血小板血漿(PRP)，剩余血樣繼續(xù)3500r/min離心10min制備貧血小板血漿(PPP)。用血液分析儀測定PPP和PRP中的血小板數(shù)，利用PPP調(diào)節(jié)PRP中的血小板數(shù)在4.0～4.5×1012個/L之間。取PPP210μL加入測試杯，進行儀器調(diào)零。再取PRP80μL，分別加入不同質(zhì)量分數(shù)的樣品液20μL，37℃孵育180s，分別加入聚集誘導劑（ADP、PAF）10μL，測定5min內(nèi)的最大聚集率。※中藥注射液※※功能主治明確※兩者原料均為銀杏葉提取物中藥生物活性測定的指導原則解讀量效關系考察：取金納多注射液，用0.9％的生理鹽水分別配制成梯度為85％、72％、61％、52％、44％的樣品液各1mL，作為對照品。取舒血寧注射液1支，用0.9％的生理鹽水分別配制成梯度為85％、72％、61％、52％、44％的樣品液各1mL，為供試品。按實驗方法分別測定含藥血漿的血小板最大聚集率。效價測定及可靠性考察：取金納多注射液，同法配置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀釋液，作為對照品組(S)；取舒血寧注射液，同法配置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀釋液，作為供試品組(T)。按照S1、Tl、T2、S2、S3、T3的順序(排除因S組和T組測定的先后次序引起的誤差)，平行測定3次。按《中國藥典》生物檢定統(tǒng)計法中量反應平行線三三法進行統(tǒng)計學處理，考察結果的可靠性，計算T組的效價(PT)和可信限率(FL％)。中藥生物活性測定的指導原則解讀效價測定結果：由于金納多注射液在藥典中尚無效價的規(guī)定，因此假設對照品(s)金納多注射液的效價為100u/mL，由于舒血寧注射液與金納多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血寧注射液抑制血小板聚集的效果與金納多相同，則其測得效價也應為100u/mL，結果見表1。表1舒血寧注射液由ADP、PAF誘導的測得效價與可信限率中藥生物活性測定的指導原則解讀可靠性考察結果：表2，表3為兩種測定方法的可靠性檢驗結果，結果顯示兩種誘導劑誘導的血小板聚集可靠性檢驗均合格，