DBS32 004-2014 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 青奧會(huì)食品中致病菌快速檢測(cè)

DBS江蘇省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布I1青奧會(huì)食品中致病菌快速檢測(cè)H7、副溶血性弧菌的病原菌自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光PCR本標(biāo)準(zhǔn)適用于2014年青奧會(huì)食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單核細(xì)病原菌自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)利用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌DNA特異片段，篩選目標(biāo)菌是否存在。反應(yīng)所需的引物、DNA聚合酶和單核苷酸等被合并成為一個(gè)穩(wěn)定、干燥的試劑片，裝入PCR反應(yīng)4.2恒溫空氣振蕩搖床：36℃±1℃、30℃±24.11pH計(jì)或pH試紙。5.2病原菌自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒（溶菌試劑金黃色葡萄球菌的樣品處理與增菌液按照GB4789.10-2010中第一法5.1進(jìn)行，氣振蕩搖床中，36℃±1℃、200rpm/min單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的樣品處理與增菌液按照GB4789.30-2010中5.1進(jìn)行，LB1增菌液放置于恒溫空氣振蕩搖床中，30℃±1℃、200rpm/min振搖2h；移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLL于恒溫空氣振蕩搖床中，36℃±1℃、200rpm/min振搖4h。3副溶血性弧菌的樣品處理與增菌液按照GB4789.7-2013中5.1進(jìn)行，增菌液床中，36℃±1℃、200rpm/min振6.1.6所有剩余增菌液均存于2℃~8℃,以備對(duì)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的確認(rèn)。6.2.1打開(kāi)加熱槽分別至37℃和95℃。檢查預(yù)冷的冷卻槽（4℃)。開(kāi)機(jī)并啟動(dòng)病原菌自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)相應(yīng)的溶菌管中，蓋上蓋子。把管架放在37℃加熱槽中20min。再將管架放在95℃的加熱槽中10min。最后將管架放在冷卻槽上（冷卻槽從冰箱取出后30min內(nèi)使用完畢），樣品冷卻5min。50μL溶菌產(chǎn)物加入管中，密封PCR反應(yīng)管。換用新吸頭，重復(fù)上述操作，直至將所有樣品轉(zhuǎn)入PCR反中保存的增菌液進(jìn)行檢測(cè)，不需要重新取樣），根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法得出的48.510×PCR緩沖液：200），）：5氣振蕩搖床中，41.5℃±1℃、200rpm/min振取9.1中培養(yǎng)的增菌液1mL，加入1.5mL無(wú)菌離心管中，8000rpm/min注：也可使用商品化的細(xì)菌DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取或陽(yáng)性菌株DNA，陰性對(duì)照為用水代替樣品進(jìn)行增菌得到的DNA則，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效，需重新實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值≥40，可判定樣品結(jié)果為陰性，直接報(bào)告目標(biāo)致病菌未6A.1致病菌實(shí)時(shí)熒光PCR法中所用的引物探針序列見(jiàn)表A.1。TGT-3’5’-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3’5’-CATTCGCGTGGCAAACATC-3’5’-AAATTACATAAAGAACGCTTT-3’5’-CTGAATCTCAAGCAAAACCCTGG-3’5’-CGCGACCGAAGCCAACTA-3’A-3’5’-ATCGCACCGTCAAAGGTC-3’A-3’TTAAGG-3’5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’5’-AAC