第十章-吸光光度法

*1第十章吸光光度法

基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸光光度法，包括比色法、可見分光光度法、紫外分光光度法及紅外光譜法等。本章重點(diǎn)討論可見光區(qū)的吸光光度法。*2有些物質(zhì)的溶液是有色的,例如KMnO4水溶液呈紫紅色,K2Cr2O7水溶液呈橙色。許多物質(zhì)的溶液本身是無(wú)色或淺色的,但它們與某些試劑發(fā)生反后生成有色物質(zhì),例如Fe3+與SCN-生成血紅色配合物；Fe2+與鄰二氮菲生成紅色絡(luò)合物。*3有色物質(zhì)溶液顏色的深淺與其濃度有關(guān),濃度愈大,顏色愈深。如果通過與標(biāo)準(zhǔn)色階比較顏色深淺的方法確定溶液中有色物質(zhì)的含量,則稱為目視比色法；如果使用分光光度計(jì),利用溶液對(duì)單色光的吸收程度確定物質(zhì)含量,則稱為分光光度法。*4第一節(jié)概述一、吸光光度法的特點(diǎn)1.光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動(dòng)性：波長(zhǎng)、頻率、光速c等參數(shù)來描述：=c在真空介質(zhì)中光速為2.9979×108m·s-1，約等于3×108m·s-1光的折射、衍射、偏振和干涉等現(xiàn)象。*5光的粒子性:(能量來描述)光是由光子流組成，光子的能量:E=h=hc/（Planck常數(shù):h=6.626×10-34J·S)光電效應(yīng)、光的吸收和發(fā)射等。*6光譜名稱波長(zhǎng)范圍躍遷類型輻射源分析方法Χ射線0.1～10nm內(nèi)層電子能級(jí)Χ射線管Χ射線光譜法遠(yuǎn)紫外光10～200nm氫、氘、氙燈真空紫外光度法近紫外光200～400nm價(jià)電子或成鍵電子能級(jí)氫、氘、氙燈紫外光度法可見光400～750nm鎢燈比色及可見光度法近紅外光0.75~2.5μm振動(dòng)能級(jí)碳化硅熱棒近紅外光度法中紅外光2.5～5μm碳化硅熱棒中紅外光度法遠(yuǎn)紅外光5～1000μm轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)碳化硅熱棒遠(yuǎn)紅外光度法微波0.1～100cm電磁波發(fā)生器微波光譜法射頻1～1000m電子自旋核自旋

核磁共振光譜法電磁波譜及各譜區(qū)相應(yīng)分析方法*7可見光是指眼睛能夠感覺到的那一小段光,是電磁波中一個(gè)很小的波段（400~750nm）。日常所見的日光、白熾光,都是由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種不同波長(zhǎng)的光所組成的復(fù)合光。

*8由不同波長(zhǎng)的光組成的光稱為復(fù)合光。單色光其實(shí)只是一種理想的“單色”,實(shí)際上常含有少量其他波長(zhǎng)的色光。各種單色光之間并無(wú)嚴(yán)格的界限。例如黃色與綠色之間就有各種不同色調(diào)的黃綠色。不僅七種單色光可以混合成白光,兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強(qiáng)度比例混合也可得到白光。這兩種單色光稱為互補(bǔ)色。*9*102.物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收及吸收曲線物質(zhì)的顏色是物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收特性表現(xiàn)在人視覺上所產(chǎn)生的反映。一種物質(zhì)呈現(xiàn)何種顏色,是與入射光的組成和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。溶液呈現(xiàn)不同的顏色是由溶液中的質(zhì)點(diǎn)（離子或分子）對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收而引起的。*11當(dāng)白光通過某一有色溶液時(shí),該溶液會(huì)選擇性地吸收某些波長(zhǎng)的光而讓未被吸收的光透射過,即溶液呈現(xiàn)透射光的顏色,亦即呈現(xiàn)的是它吸收光的互補(bǔ)光的顏色。例如,KMnO4溶液選擇吸收了白光中的綠色光,與綠色光互補(bǔ)的紫色光因未被吸收而透過溶液,所以KMnO4溶液呈現(xiàn)紫色。*12當(dāng)依次將各種波長(zhǎng)的單色光通過某一有色溶液,測(cè)量每一波長(zhǎng)下有色溶液對(duì)該波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度A）,然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)作圖,得到一條曲線,稱為該溶液的吸收曲線。右圖為K2Cr2O7和KMnO4溶液的吸收曲線。*13吸收曲線的討論:（1）同一種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)λmax（2）不同濃度的KMnO4溶液的光吸收曲線形狀相似,其最大吸收波長(zhǎng)不變；不同物質(zhì)吸收曲線的形狀和最大吸收波長(zhǎng)均不相同。光吸收曲線與物質(zhì)特性有關(guān),故據(jù)此可作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)。*14（3）同一物質(zhì)不同濃度的溶液,在一定波長(zhǎng)處吸光度隨溶液的濃度的增加而增大。這個(gè)特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。在測(cè)定時(shí),只有在λmax處測(cè)定吸光度,其靈敏度最高。因此,吸收曲線是吸光光度法中選擇測(cè)量波長(zhǎng)的依據(jù)。*153.特點(diǎn)a.靈敏度高常用于測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-2~10-5的微量組分，甚至可測(cè)定低至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-6~10-8的痕量組分。通常所測(cè)試的濃度下限達(dá)10-5~10-6mol·L-1。

b.準(zhǔn)確度高一般目視比色法的相對(duì)誤差為5%~10%，分光光度法為2%~5%。*16c.應(yīng)用廣泛幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物都可以直接或間接地用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。不僅用于測(cè)定微量組分,也能用于高含量組分的測(cè)定、絡(luò)合物組成、化學(xué)平衡等的研究。d.儀器簡(jiǎn)單、操作方便、快速近年來,由于新的、靈敏度高、選擇性好的顯色劑和掩蔽劑的不斷出現(xiàn),以及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的應(yīng)用,常?？梢圆唤?jīng)分離就能直接進(jìn)行分光光度測(cè)定。*17

二、光吸收的基本定律1.朗伯—比爾定律設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia，透射光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir，則：I0=Ia+It+Ir由于反射光強(qiáng)度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡(jiǎn)化為：I0=Ia+It*18透光度:透過光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比，用T表示:即吸光度:為透光度倒數(shù)的對(duì)數(shù)，用A表示:即

*19

二.朗伯—比耳定律朗伯(Lambert)于1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:*20式中A:吸光度，描述溶液對(duì)光的吸收程度；b:液層厚度(光程長(zhǎng)度)，通常以cm為單位；c:溶液的摩爾濃度，單位mol·L-１；ε:摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-１·cm-１；*21應(yīng)用朗伯－比耳定律時(shí)應(yīng)注意:（1）朗伯-比耳定律不僅適用于有色溶液，也可適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)（包括液體、氣體和固體）；（2）該定律應(yīng)用于單色光，既適用于可見光，也適用于紅外光和紫外光，是各類吸光光度法的定量依據(jù)；（3）吸光度具有加和性，是指溶液的總吸光度等于各吸光物質(zhì)的吸光度之和。根據(jù)這一規(guī)律，可以進(jìn)行多組分的測(cè)定及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定。*22摩爾吸光系數(shù)ε的討論（1）吸收物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù),可作為定性鑒定的參數(shù)；（2）不隨濃度c和光程長(zhǎng)度b的改變而改變。在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí),ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān),與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)；（3）同一吸收物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的ε值是不同的。在最大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸光系數(shù),常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力,也反映了光度法測(cè)定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。*23（4）εmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度越高。ε>105:超高靈敏；ε=(6～10）×104:高靈敏；ε<2×104:不靈敏。（5）ε在數(shù)值上等于濃度為1molL-1.液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度。*24三、比色法和吸光光度法及其儀器（一）目視比色法目視比色法是一種用眼睛辨別顏色深淺,以確定待測(cè)組分含量的方法。一般采用標(biāo)準(zhǔn)系列法。即在一套等體積的比色管中配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液,并按同樣的方法配制待測(cè)溶液,待顯色反應(yīng)達(dá)平衡后,從管口垂直向下觀察,比較待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列中哪一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色相同,便表明二者濃度相等。如果待測(cè)試液的顏色介于某相鄰兩標(biāo)準(zhǔn)溶液之間,則待測(cè)試樣的含量可取兩標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的平均值。*25方法的特點(diǎn):a.利用自然光，無(wú)需特殊儀器;b.比較的是吸收光的互補(bǔ)色光;c.目測(cè)，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高;d.準(zhǔn)確度低（一般為半定量）;e.不可分辨多組分。*26（二）吸光光度法1.方法原理吸光光度法是借助分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)朗伯－比耳定律確定物質(zhì)溶液的濃度的方法。常用的測(cè)定方法有比較法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法。*27

兩式相比得:

則得2.測(cè)定方法a.比較法比較法是先配制與被測(cè)試液濃度cx相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液cs，在相同條件下顯色后，測(cè)其相應(yīng)的吸光度，分別為As和Ax，根據(jù)朗伯—比耳定律:*28AxAccx0b.標(biāo)準(zhǔn)曲線法借助分光光度計(jì)來測(cè)量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將吸光度對(duì)濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)被測(cè)試液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得被測(cè)物質(zhì)的濃度或含量。當(dāng)測(cè)試樣品較多時(shí)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法比較方便，而且誤差較小。*29（三）儀器

可見分光光度計(jì)*30儀器

紫外-可見分光光度計(jì)*311.基本組成光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示1.光源在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜,具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。可見光區(qū):鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在320～2500nm。紫外區(qū):氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。*32

2.單色器將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。 棱鏡:玻璃350～3200nm，石英185～4000nm。光柵:波長(zhǎng)范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便。*33棱鏡:依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過棱鏡時(shí)折射率不同單色器入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400*34光柵:在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理:利用光通過光柵時(shí),發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.*353.樣品室樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池,可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測(cè)器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào),常用的有光電池、光電管或光電倍增管。*365.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理*37練習(xí)題(1)人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長(zhǎng)范圍是()A400~780nmB200~320nmC200~780nmD200~1000nm答案:A(2)符合比爾定律的一有色溶液，當(dāng)其濃度增大時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)和吸光度分別是()A不變，增加B不變，減少C增加，不變D減少，不變答案:A*38(3)下列表述不正確的是()A吸收光譜曲線表明了吸光度隨波長(zhǎng)的變化關(guān)系B吸收光譜曲線中最大吸收處的波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)C吸收光譜曲線以波長(zhǎng)為縱坐標(biāo),以吸光度為橫坐標(biāo)D吸收光譜曲線表明了吸光物質(zhì)的吸收特性答案:C(4)影響有色物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)的因素是()A吸收池厚度B入射光波長(zhǎng)C有色物質(zhì)溶液的濃度D入射光的強(qiáng)度答案:B*39(5)某有色物質(zhì)溶液,遵守比爾定律,當(dāng)其濃度為c時(shí),用1.00cm比色皿測(cè)得其透光度為T,當(dāng)濃度減小為0.50c時(shí),在同樣條件下測(cè)定,其透光率應(yīng)為（）AT2B2TCT1/2DT/2答案:C(6)紫外可見分光光度計(jì)在可見區(qū)測(cè)量時(shí)所用光源是（）A氫燈B鎢燈C空心陰極燈D紅外燈答案:B*40第二節(jié)光度分析法的設(shè)計(jì)*41

一、顯色反應(yīng)測(cè)定某種物質(zhì)時(shí),如果待測(cè)物質(zhì)本身有較深的顏色,就可以進(jìn)行直接測(cè)定,但大多數(shù)待測(cè)物質(zhì)是無(wú)色或很淺的顏色,故需要選適當(dāng)?shù)脑噭┡c被測(cè)離子反應(yīng)生成有色化合物再進(jìn)行測(cè)定。此反應(yīng)稱為顯色反應(yīng),所用的試劑稱為顯色劑。*421．顯色反應(yīng)的選擇顯色反應(yīng)主要有絡(luò)合反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，當(dāng)同一組分可與多種顯色劑反應(yīng)生成不同的有色化合物。選用哪一種顯色反應(yīng)呢？對(duì)顯色反應(yīng)的選擇，有下列考慮：*43a.選擇靈敏度高,即摩爾吸光系數(shù)大的反應(yīng)。在滿足測(cè)定靈敏度的前提下,選擇性的好壞常常成為選擇顯色反應(yīng)的主要依據(jù)。Fe(Ⅱ)與1,10-二氮菲在pH=2～9的水溶液中生成橙紅色配合物的反應(yīng),雖然靈敏度不是很高,ε508=1.1×104L·mol-1?cm-1,但由于選擇性好,在實(shí)際分析中仍廣泛被采用。*44b.有色化合物的組成恒定,符合一定的化學(xué)式。對(duì)于形成不同配位比的絡(luò)合反應(yīng),必須控制實(shí)驗(yàn)條件,使其生成一定組成的絡(luò)合物,以免引起誤差。c.有色化合物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)足夠穩(wěn)定,至少保證在測(cè)量過程中溶液的吸光度基本恒定。這就要求有色化合物不容易受外界環(huán)境條件的影響,如日光照射、空氣中的氧和二氧化碳的作用等。*45d.有色化合物與顯色劑的關(guān)系差別要大,即顯色劑對(duì)光的吸收與絡(luò)合物的吸收有明顯區(qū)別,一般要求兩者的吸收峰波長(zhǎng)之差△λ（稱為對(duì)比度）大于60nm。*462.顯色劑(1)無(wú)機(jī)顯色劑:應(yīng)用不多，因其生成絡(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度選擇性也不高。目前有使用價(jià)值的主要有:硫氰酸鹽:測(cè)定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb5+等。鉬酸銨:測(cè)定P、Si、W等。過氧化氫:測(cè)定V5+、Ti4+等*47(2)有機(jī)顯色劑:能與金屬離子生成極其穩(wěn)定的螯合物，具有特征顏色，其選擇性，靈敏度均高。不少螯合物易溶于有機(jī)溶劑，可以進(jìn)行萃取比色。偶氮類:偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等；三苯甲烷類:鉻天青S，二甲酚橙，結(jié)晶紫等；*48*49二、顯色反應(yīng)條件的選擇確定了顯色反應(yīng)以后，還要確定合適的反應(yīng)條件，這一般是通過實(shí)驗(yàn)研究來確定的。這些實(shí)驗(yàn)條件包括:溶液酸度、顯色劑用量、試劑加入順序、顯色時(shí)間、顯色溫度、有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。*50c(R)c(R)c(R)顯色劑用量（c(M)、pH一定）為了使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全,一般需加入過量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。對(duì)于有些顯色反應(yīng),顯色劑加入太多,反而會(huì)引起副反應(yīng),對(duì)測(cè)定不利。在實(shí)際工作中,通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)來確定顯色劑的用量。Mo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅Fe(SCN)n3-n*51

顯色反應(yīng)酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH*52例如,Fe(Ⅲ)與磺基水楊酸的反應(yīng)隨pH的改變,產(chǎn)物的組成和顏色會(huì)產(chǎn)生明顯的改變。pH為1.8～2.5時(shí),形成1:1的紫紅色配合物；pH=4～8時(shí),生成1:2的橙紅色配合物；pH為8～11.5時(shí),生成1:3的黃色配合物；pH>12時(shí),只能生成棕紅色的Fe(OH)3沉淀。*53

顯色溫度及顯色時(shí)間T1(℃)T2(℃)t(min)A*54通常，顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是，有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度才能完成。例如:用硅鉬酸法測(cè)定硅的反應(yīng)，在室溫下需10min以上才能完成；而在沸水浴中，則只需30s便能完成。許多有色化合物在溫度較高時(shí)容易分解，如MnO溶液長(zhǎng)時(shí)間煮沸就會(huì)與水中的微生物或有機(jī)物反應(yīng)而褪色。同樣可以通過實(shí)驗(yàn)確定顯色反應(yīng)的適宜溫度。*555.溶劑有機(jī)溶劑常降低有色化合物的離解度，從而提高了顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入與水混溶的有機(jī)溶劑(如丙酮)，由于降低了Fe(SCN)3的解離度而使顏色加深，提高了測(cè)定的靈敏度。有機(jī)溶劑還可能提高顯色反應(yīng)的反應(yīng)速率，影響有色配合物的溶解度和組成等。用氯代磺酚S法測(cè)定鈮(V)時(shí)，在水溶液中顯色需幾小時(shí)，加入丙酮后，則只需30min。*566.干擾及其消除方法試樣中存在干擾物質(zhì)會(huì)影響被測(cè)組分的測(cè)定。例如干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑反應(yīng)，在測(cè)量條件下也有吸收，造成正干擾。干擾物質(zhì)均與被測(cè)組分反應(yīng)或與顯色劑反應(yīng)，使顯色反應(yīng)不完全，也會(huì)造成干擾。干擾物質(zhì)在測(cè)量條件下從溶液中析出，使溶液變混濁，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定溶液的吸光度。*57選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL(zhǎng)根據(jù)吸收曲線,以選擇被測(cè)組分具有最大吸收時(shí)的波長(zhǎng)(λmax)的光作為入射光,這稱為“最大吸收原則”。選用λmax的光作為測(cè)量波長(zhǎng),不僅靈敏度高,而且能夠減少或消除由非單色光引起的對(duì)朗伯一比耳定律的偏離。但是若在λmax處有其他吸光物質(zhì)干擾測(cè)定時(shí),則應(yīng)根據(jù)“吸收最大,干擾最小”的原則來選擇測(cè)量波長(zhǎng),即可選用靈敏度稍低但能避開干擾的入射光進(jìn)行測(cè)定。*58選擇合適的參比溶液基于吸光度具有加和性，可選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤簛碚{(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)。它可以消除由于吸收池壁及溶劑、試劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來的誤差，并可扣除干擾的影響。參比溶液的選擇一般遵循以下原則:a.如果僅待測(cè)物與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有色時(shí)，可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤?，稱為“溶劑空白”。一般用蒸餾水作參比溶液。*59b.當(dāng)樣品溶液無(wú)色,而顯色劑及試劑有色時(shí),可用不加樣品的顯色劑、試劑的溶液作參比溶液,稱為“試劑空白”。c.當(dāng)樣品溶液中其他離子有色,而試劑、顯色劑無(wú)色時(shí),應(yīng)采用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液,稱為“樣品空白”。此外,有時(shí)可改變加入試劑的順序,使待測(cè)組分不發(fā)生顯色反應(yīng),可以用此溶液作為參比溶液?？傊?選擇參比溶液總的原則是,使試液的吸光度真正反映待測(cè)組分的濃度。*60第三節(jié)光度分析法的測(cè)量誤差*61一、偏離朗伯—比耳定律的原因標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn):標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）:（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)性因素。*62（1）物理性因素

難以獲得真正的純單色光。朗伯—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對(duì)朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光都會(huì)引起對(duì)朗伯—比耳定律的偏離,最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。*63(2)化學(xué)性因素朗伯—比耳定律的假定:所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2molL-1)時(shí)才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10-2molL-1時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對(duì)光的吸收。故:朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí),使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。*64例:鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡:CrO42-+2H+=Cr2O72-+H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時(shí)溶液pH對(duì)測(cè)定有重要影響。所以，在用吸光光度法進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)，要控制溶液的條件，使被測(cè)組分以一種形式存在，就可以克服化學(xué)因素引起的偏離。*65

x104

(nm)亞甲藍(lán)陽(yáng)離子水溶液的吸收光譜a.6.36×10-6molL-1b.1.27×10-4molL-1c.5.97×10-4molL-1亞甲藍(lán)陽(yáng)離子單體

max=660nm二聚體

max=610nm二聚體的生成破壞了A與c的線性關(guān)系*66吸光度測(cè)量的誤差在吸光光度法分析中,除了前面已講述的偏離朗伯—比耳定律所引起的誤差外,儀器測(cè)量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來源。這些誤差可能來源于光源不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)條件的偶然變動(dòng)、讀數(shù)不準(zhǔn)確及儀器噪音等。其中透光度與吸光度的讀數(shù)誤差是衡量測(cè)定結(jié)果的主要因素,也是衡量?jī)x器精度的主要指標(biāo)之一。*67在光度計(jì)中,透光度的標(biāo)尺刻度是均勻的,吸光度與透光度成負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系,故吸光度的標(biāo)尺刻度是不均勻的。光度計(jì)算尺上吸光度與透光度的關(guān)系,如圖所示。對(duì)一給定的分光光度計(jì),透光度讀數(shù)誤差△T約為0.01~0.02,基本上為一常數(shù)。但在不同吸光度范圍內(nèi)讀數(shù)將對(duì)測(cè)定帶來不同程度的誤差,因?yàn)槲舛葴y(cè)量的誤差不為常數(shù)。吸光度越大,讀數(shù)波動(dòng)所引起的吸光度讀數(shù)誤差也越大。*68最佳讀數(shù)范圍與最佳值設(shè):ΔT=1%，則可繪出溶液濃度相對(duì)誤差Δc/c與其透光度T的關(guān)系曲線。如圖所示:當(dāng):ΔT=1%，T在15%～65%之間時(shí)，濃度相對(duì)誤差較小，是最佳讀數(shù)范圍。濃度相對(duì)誤差最小時(shí)的透光度Tmin為:Tmin＝36.8%,Amin＝0.434

用儀器測(cè)定時(shí)應(yīng)盡量使溶液透光度值在T%=15～65%(吸光度A=0.80～0.20)。*69在實(shí)際測(cè)定時(shí),只有使待測(cè)溶液的透光度T在15%~65％之間,或使吸光度A在0.2~0.8之間,才能保證濃度測(cè)量的相對(duì)誤差較小(∣Er∣<4％)。當(dāng)透光度T=36.8％或A=0.434時(shí),濃度測(cè)量的相對(duì)誤差最小。*70練習(xí)題(1)在光度分析中，選擇參比溶液的原則是()A一般選蒸餾水B一般選試劑溶液C根據(jù)加入試劑和被測(cè)試液的顏色性質(zhì)選擇D一般選褪色溶液答案:C*71(2)下列幾組吸光度范圍,測(cè)量相對(duì)誤差較小的是()A0.2~0.8B0.1~0.8C0.3~0.6D0.2~0.6答案:C(3)下列表述中錯(cuò)誤的是()A吸收峰隨濃度增加而增高，但最大吸收波長(zhǎng)不變B透射光與吸收光互為補(bǔ)色光，黃色和蘭色互補(bǔ)C比色法又稱分光光度法D在公式A=εbc中，ε稱摩爾吸收系數(shù)，其數(shù)值越大，越靈敏答案:C*72(4)某有色物質(zhì)溶液的吸光度值較小時(shí),則表明()A該物質(zhì)的濃度較小B該物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)較小C所用比色皿較薄D上述三者都可能答案:D(5)一有色溶液在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光度為0.740，如果溶液及比色皿都減小一半，則其吸光度為()A2.96B0.740C0.370D0.185答案:D*73(6)為使某待測(cè)物質(zhì)測(cè)定的靈敏度較高,則應(yīng)選擇()A較高濃度的待測(cè)溶液B采用具有較大吸收系數(shù)的體系C在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)下進(jìn)行D用較強(qiáng)的光源答案:B*74第四節(jié)其它吸光光度法和光度分析法的應(yīng)用*75一、普通分光光度法1.單組分的測(cè)定通常采用A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。*762.多組分的同時(shí)測(cè)定⑴若各組分的吸收曲線互不重疊,則可在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。這本質(zhì)上與單組分測(cè)定沒有區(qū)別。⑵若各組分的吸收曲線互有重疊,則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。Aλ1=εaλ1bca＋εbλ1bcbAλ2=εaλ2bca＋εbλ2bcb*77二、示差分光光度法（示差法）普通分光光度法一般只適于測(cè)定微量組分，當(dāng)待測(cè)組分含量較高時(shí)，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法，即提高入射光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測(cè)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。設(shè):待測(cè)溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs<cx)。則:Ax=εbcx；As=εbcsΔＡ=Ａx-Ａs=εb(cx-cs）=εbΔc測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差ΔＡ。*78ΔA＝Ax-As=εb(cx-cs）=εbΔc測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差ΔA。示差法測(cè)得的吸光度與Δc呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的Δc值，則待測(cè)溶液濃度cx:cx=cs+Δc標(biāo)準(zhǔn)曲線法是通過用一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液與作為參比溶液的稀標(biāo)準(zhǔn)溶液cs測(cè)得的吸光度△A，對(duì)相應(yīng)的濃度差△c作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)得的待測(cè)液的△Ax，在圖中查出△cx值，再?gòu)腸x=cs+△cx求出待測(cè)試液的濃度。*79示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理:普通法:cs的T=10%；cx的T=5%示差法:cs做參比，調(diào)T=100%則:cx的T=50%；標(biāo)尺擴(kuò)展10倍*80設(shè)按一般吸光光度法用試劑空白作參比溶液,測(cè)得試液的透光度ＴX＝5%,這時(shí)的測(cè)量誤差是很大的。采用示差吸光光度法時(shí),若按一般吸光光度法測(cè)得T1=10%的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液,即使其透光率從標(biāo)尺上的T1=10%處調(diào)至T2=100％處時(shí),相當(dāng)于把標(biāo)尺擴(kuò)展到原來的十倍(T2/T1=100%/%=10)。這樣待測(cè)試液透光度原來為5％,讀數(shù)落在測(cè)量誤差很大的區(qū)域,改為用示差法測(cè)定時(shí),透光