化學品 魚類早期生活階段毒性試驗 征求意見稿

1GB/T21854—XXXX化學品魚類早期生活階段毒性試驗本文件規(guī)定了化學品魚類早期生活階段毒性試驗的方法概述、試驗系統(tǒng)、試驗程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)與報告。本文件適用于確定化學品對受試生物在早期生活階段的致死和亞致死效應，以評價對其他魚種的慢性致死效應和亞致死效應。2術語和定義下列術語和定義適用于本文件。2.1魚叉長fishforklength，F(xiàn)FL從吻尖到中尾鰭線末端的直線距離，用于難以分辨脊椎柱末端的魚類體長測量。2.2魚標準長fishstandardlength，F(xiàn)SL從吻尖到尾鰭基部最后一節(jié)椎骨的末端或到尾鰭基部的直線距離，不包括尾鰭長度。2.3魚全長fishtotallength，F(xiàn)TL從吻尖到尾鰭較長葉末端的直線距離。2.4效應濃度effectconcentration，ECx在給定測試周期內(nèi)，與對照組相比，導致x%受試生物出現(xiàn)某觀察效應的受試物濃度。2.5最低可觀察效應濃度lowestobservedeffectconcentration，LOEC在給定試驗周期內(nèi)，與對照組相比，在統(tǒng)計學意義上對受試生物產(chǎn)生顯著效應（p＜0.05）的最低受試物濃度。2.6無可觀察效應濃度noobservedeffectconcentration，NOEC在給定試驗周期內(nèi)，與對照組相比，在統(tǒng)計學意義上對受試生物未產(chǎn)生顯著效應（p>0.05）的最高受試物濃度。2.7不明復雜物質(zhì)UVCB2GB/T21854—XXXX組分未知或可變的物質(zhì)、復雜反應產(chǎn)物或生物材料。3受試物信息a)結構式；b)純度；c)水中溶解度；d)蒸氣壓；e)水中解離常數(shù)（pKa）；f)正辛醇/水分配系數(shù)（POW）；g)在水中、光中、試驗條件下的穩(wěn)定性；h)相同魚種的急性毒性試驗結果；i)快速生物降解性試驗結果；j)在試驗溶液中受試物的可靠定量分析方法及其精確度、檢測限；k)受試物為混合物的，其成分標識信息、數(shù)量、物質(zhì)特性。4方法概述4.1原理將處于早期生活階段的魚（或胚胎）暴露于一定濃度范圍的受試物水溶液中，優(yōu)先采用流水條件進行試驗，若流水條件不可行，也可采用半靜態(tài)條件。開始試驗時，將受精卵放入試驗容器中，至對照組中的魚達到幼魚生活階段時方可結束試驗。通過評價致死和亞致死效應，以及與對照組的比較來確定受試物的最低可觀察效應濃度（LOEC）和無可觀察效應濃度（NOEC或者通過回歸模型計算得到效應濃度ECx（如EC10,EC20）。相關效應濃度ECx取決于監(jiān)管要求，測試濃度范圍應涵蓋ECx并通過內(nèi)插法計算效應值。4.2參比物無推薦參比物。5儀器設備溶解氧測定儀；水硬度計；pH計；分析天平；溫度控制儀；水質(zhì)測定儀器；受試物分析儀器；樣品前處理儀器設備；全玻璃、不銹鋼或其他化學惰性材質(zhì)的試驗容器；流水式系統(tǒng)；3GB/T21854—XXXX實驗室常用玻璃器皿。6試驗系統(tǒng)6.1受試魚類推薦使用的淡水魚種為稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）和斑馬魚（Daniorerio）等，詳見表1。使用其他魚種時，試驗條件應作相應調(diào)整，并在報告中說明魚種選擇理由和試驗方法。推薦魚種的試驗條件、周期和存活率見附錄A，推薦的受試生物及其喂養(yǎng)、繁殖操作要求見附錄B。表1推薦的受試魚種6.2試驗用水6.2.1水質(zhì)可用曝氣除氯的自來水，高質(zhì)量的天然水或標準稀釋水。整個試驗期間水質(zhì)應保持恒定。定期取樣分析。若稀釋水質(zhì)量穩(wěn)定，每隔半年測定重金屬、主要的陰離子和陽離子、氨、有機氯農(nóng)藥殘留、總有機碳以及懸浮物等指標。如稀釋水質(zhì)量不穩(wěn)定，則應增加測定頻次。合格稀釋水的化學特性如附錄C所列。6.2.2試驗溶液流水式試驗中，必須具備受試物貯備液連續(xù)分配和稀釋系統(tǒng)。試驗期間定期檢查貯備液和稀釋水的流量變化應不大于10％。通常每24h的溶液流量應不少于試驗容器體積的5倍。在滿足本文件規(guī)定的承載率（單位體積試驗溶液中的生物量）下，也可以設定較低的溶液流速（如2~3個試驗容器體積/24h以防止食物被快速清除。試驗溶液通過稀釋受試物貯備液進行制備。受試物貯備液最好采用機械方法（如攪拌或超聲）進行制備，也可采用飽和柱法和被動加標法制備貯備液。某些情況下，為配制適當濃度的貯備液，可使用助溶劑。若使用助溶劑，應同時設置溶劑對照，溶劑對照組中溶劑水平應與所有處理組相同。如果難以實現(xiàn)，溶劑對照組的溶劑水平應與受試物處理組的最高溶劑水平相等。溶劑濃度應盡可能低，不得高于100μl/L。采用半靜態(tài)試驗時，可以將存活的受精卵或仔魚移入裝有新試驗溶液的試驗容器中，或?qū)⑹茉嚿锪粼谠囼炄萜鲀?nèi)，更換一定比例的試驗溶液，更換量不少于2/3。7試驗程序7.1準備7.1.1試驗容器4GB/T21854—XXXX用全玻璃、不銹鋼或其他化學惰性材質(zhì)制成，其尺寸應符合承載率的要求。由于有機硅對親脂性物質(zhì)有較強的吸附能力，流水式試驗中盡量減少使用有機硅耗材。試驗容器應在試驗區(qū)域內(nèi)隨機擺放，避免不必要的干擾。受試生物應在暴露濃度穩(wěn)定后再加入。7.1.2受精卵、胚胎和仔魚的處理試驗開始時，將受精卵、胚胎和仔魚置于小的玻璃容器或不銹鋼容器中，并放置在一個更大的容器中進行暴露，小容器的側(cè)壁或底部有網(wǎng)，以便試驗溶液能夠流經(jīng)這些小容器。若有必要讓溶液在這些小容器中產(chǎn)生非湍流流動，可以將它們固定在懸臂上，通過懸臂能使小容器浮在溶液中并上下移動，但要始終保持受試生物浸沒在溶液中。支撐受精卵的架子或者網(wǎng)格需要有足夠大的孔徑，以保證仔魚孵化后能夠落進大容器中。仔魚孵出后，根據(jù)不同種類的受試魚，需要將大容器內(nèi)用于放置魚卵的小容器、格柵或網(wǎng)移除，除非這些網(wǎng)被用于防止受試仔魚逃逸。如果有必要將仔魚移出魚卵孵化容器，轉(zhuǎn)移時仔魚不得暴露于空氣中，也不得用網(wǎng)具撈取。轉(zhuǎn)移仔魚的時機因種類而異，是否轉(zhuǎn)移應根據(jù)需要而定。7.1.3暴露條件a)持續(xù)時間：在卵受精后應盡快開始試驗。在囊胚開始卵裂之前，應將囊胚浸在試驗溶液中，或盡可能地接近該階段開始試驗。試驗持續(xù)時間取決于所選魚種（參見附錄B）。b)承載率：試驗開始時，受精卵的數(shù)量應滿足統(tǒng)計學的需要。受精卵隨機分配于各濃度組，每個濃度組至少80粒卵，平均分配到至少4個平行組。承載率應足夠低，以保證卵和仔魚階段在沒有曝氣的情況下，試驗溶液的溶解氧濃度不低于60％空氣飽和值。流水式試驗中，24h承載率不超過0.5g濕重/L，且任何時刻容器內(nèi)溶液的承載率不超過5g/L。c)光照和溫度：光周期和水溫應適合受試生物（見附錄A）。d)喂食：對不同生長階段的魚適時適量投餌。除非根據(jù)死亡率進行調(diào)整喂食量，否則每個平行的喂食量應大致相等。及時清除剩余食物和糞便。根據(jù)物種和生活階段，可用活食作為干食或冷凍食物的替代或補充。喂食方案參見附錄B。7.1.4試驗濃度可根據(jù)相關急性毒性試驗或預實驗結果設定試驗濃度范圍，通常以幾何級數(shù)設置5個受試物濃度，每個濃度至少4個平行，濃度的間隔系數(shù)不大于3.2。如果僅僅為了獲得NOEC，可開展少于5個濃度的限度試驗或擴展限度試驗的試驗設計，但應說明濃度設置少于5個的理由。試驗最高濃度不超過96hLC50值或10mg/L（二者取較低值）。在試驗系列中必須設置一個試驗用水對照組，如果試驗中使用了助溶劑，還需要設置一個助溶劑對照組。7.2試驗操作7.2.1分析與測定頻次需建立適當?shù)姆治龇椒?，以有效測定試驗系統(tǒng)中受試物濃度，包括合適的定量限(LOQ)以及受試物在試驗系統(tǒng)中穩(wěn)定性的充分信息等。試驗期間，受試物濃度應定期測定至少5次。流水式試驗中，應至少每周對每個濃度的一個平行進行濃度測定，每次選擇不同平行進行測定。樣品應通過過濾（例如使用0.45μm孔徑濾膜）或離心去除顆粒物質(zhì)以確保對真溶液中的受試物進行測定。濾膜使用前要進行飽和以減少對受試物的吸附。當測定濃度不在配制濃度的80-120%范圍內(nèi)時，效應濃度應以時間加權算數(shù)平均值表示，計算方法見附錄F。5GB/T21854—XXXX試驗期間，應至少每周測量一次所有試驗容器中的溶解氧、pH值和溫度，如有必要，還應在測試開始和結束時測量鹽度和硬度。最好對一個試驗容器中的溫度進行連續(xù)監(jiān)測。7.2.2胚胎發(fā)育階段準確地記錄試驗開始時胚胎發(fā)育所處的時期?？杀４嬗写硇缘那鍧嵉穆炎鳂颖?。7.2.3孵出和存活每天觀察一次仔魚的孵出與存活情況，并記錄數(shù)量。如在胚胎發(fā)育早期(例如，在試驗的第一天或第二天)觀察到卵上有真菌，應將這些卵計數(shù)并移除。移走死亡的胚胎、仔魚和稚魚。移除死亡個體時應避免磕碰周圍的卵或仔魚，以免對其造成物理傷害。各生活階段的死亡判斷標準如下：——受精卵：特別是在早期階段，由于蛋白質(zhì)的凝固作用和/或沉降作用，引起半透明狀消失和顏色變化，導致受精卵變?yōu)榘咨煌该鳡??！咛?，仔魚和稚魚：不動和/或沒有呼吸運動和/或沒有心跳和/或?qū)C械刺激沒有反應。7.2.4異常表征記錄應根據(jù)試驗周期和出現(xiàn)畸形的類型，定期記錄畸形仔魚或稚魚的數(shù)量。本文件中推薦的大多數(shù)物種的胚胎通常會正常發(fā)育。應該注意某些魚種可能自然發(fā)生胚胎和仔魚的畸形，其在對照組中的發(fā)生率約為幾個百分點。如果畸形和相關的異常行為非常嚴重，以至于受試生物遭受了極大的痛苦，并且已經(jīng)達到了無法恢復的程度，則可以將其從測試中移除。應該將這些受試魚安樂死處理并記錄為死亡，以進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。7.2.5異常行為記錄根據(jù)試驗周期定期記錄（如溫水魚每天記錄）異常行為，如呼吸急促、游動失調(diào)、反常的靜止和異常的攝食等。雖然這些異常行為難以定量分析，但有助于解釋死亡率數(shù)據(jù)。7.2.6重量稱量試驗結束時，對所有存活的魚進行稱重，至少以每個平行中所有存活的魚為一組進行稱重（報告中應表明每個平行受試魚數(shù)量和平均體重）：優(yōu)選濕重（吸干魚體表面水分），但也可以報告干重數(shù)據(jù)。7.2.7長度測量在試驗結束時，建議逐一測量魚體長度，推薦使用魚全長，但如果尾鰭腐爛或腐蝕，應采用魚標準長。在一個試驗中，所有的魚都應該使用相同的方法進行測量?？梢酝ㄟ^卡尺、數(shù)碼相機或校準的目測千分尺來測量。附錄A中描述了各類受試魚的典型最小長度。8質(zhì)量保證與質(zhì)量控制有效的試驗應滿足以下的條件：a）試驗期間，溶解氧濃度應大于60％的空氣飽和值；b）試驗期間，各試驗容器之間或各連續(xù)時間內(nèi)的水溫差不能超過±1.5℃,且應在受試生物適宜的溫度范圍內(nèi)（附錄A）；c）必須對受試溶液濃度進行測定；d）對照組和溶劑對照組（如有）中受精卵的總存活率和孵化后存活率應大于或等于附錄A中規(guī)定的限定值。6GB/T21854—XXXX9數(shù)據(jù)與報告9.1數(shù)據(jù)處理當需要報告NOEC時，應選擇足夠效能(≥80%)的統(tǒng)計檢驗和試驗設計用于評估毒性終點的重要生物學變化。相關效應濃度和參數(shù)的報告可能取決于法規(guī)要求。如果要報告ECx，試驗的設計和回歸模型的選擇應允許估計ECx，以便報告的ECx（1）95%置信限不包含零且不過寬2）ECx預測均值的95%置信限不包含對照均值3）數(shù)據(jù)回歸模型擬合時沒有明顯的缺失。試驗設計時，應考慮重要毒性終點的檢測和估計，無論哪種方法都需確定每個終點的變化百分比。當上述條件不能確定ECx時，應采用NOEC方法。相同的百分比變化不太可能適用于所有終點，也不太可能設計出滿足所有終點標準的可行試驗，因此關注終點是很重要的，這對于相應試驗在適當設計試驗時非常重要。附錄D和E中提供了每種方法的統(tǒng)計流程圖和指南，用于指導數(shù)據(jù)處理和選擇最合適的統(tǒng)計檢驗或模型。如果有科學依據(jù)，也可以使用其他統(tǒng)計方法。有必要使用方差分析或列聯(lián)表程序分析每組平行中的差異，并根據(jù)該分析使用適當?shù)慕y(tǒng)計分析方法。為了在各濃度的結果和對照的結果之間進行多重比較，當數(shù)據(jù)呈現(xiàn)單調(diào)濃度-效應關系且超二項式方差不顯著時，對于連續(xù)數(shù)據(jù)，建議使用step-downJonckheere-Terpstra檢驗或Williams檢驗；對于二項數(shù)據(jù)，建議使用step-downCochran-Armitage檢驗；當超二項式方差顯著時，建議采用Rao-Scott改良的Cochran-Armitage檢驗，或者采用Williams、Dunnett（在反正弦平方根變換后）或Jonckheere-Terpstra檢驗。當數(shù)據(jù)呈現(xiàn)非單調(diào)濃度-效應關系時，對于連續(xù)數(shù)據(jù)，建議使用Dunnett或Dunn或Mann-Whitney檢驗，對于二項數(shù)據(jù)，建議使用Fisher檢驗。應注意在應用任何統(tǒng)計方法或模型時，需滿足方法或模型的要求（例如，在試驗設計和使用的檢驗方法和模型中應考慮試驗容器之間的差異）。應評估數(shù)據(jù)的正態(tài)性，附錄D指出了應該如何處理來自ANOVA的殘差。附件E討論了回歸方法的其他考慮因素。為了滿足統(tǒng)計檢驗的要求，應考慮對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換。然而，需特別注意為了擬合回歸模型而進行的轉(zhuǎn)換，例如，未轉(zhuǎn)換響應的25%變化并不對應于轉(zhuǎn)換響應的25%變化。在所有分析中，應將測試容器而不是單個受試魚作為統(tǒng)計檢驗單位，并在假設檢驗和回歸分析中有所體現(xiàn)。9.2試驗報告試驗報告應包括下列內(nèi)容：受試物單一成分物質(zhì)——外觀、水溶解度和其他相關理化特性；——化學標識，如IUPAC（國際純粹與應用化學聯(lián)合會）或CAS名稱、CAS號、SMILES（簡化分子線性輸入規(guī)范）或InChI（國際化合物標識）代碼、結構式、純度、雜質(zhì)的化學標識（如有）等（如有，包括有機碳含量）。多組分物質(zhì)，UVCBs和混合物——盡可能表征，例如通過化學鑒定數(shù)據(jù)（見上文）、定量分析和成分的相關物理化學性質(zhì)。b）受試生物——學名、品系、來源、受精卵的收集及處理方法。c）試驗條件——所用試驗程序（如半靜態(tài)或流水式，承載率——光周期；——試驗設計（如試驗容器及其平行的數(shù)量，每個平行中的胚胎數(shù)、試驗容器的材料和尺寸(高度、寬度、體積)、每個試驗容器中的水體積)；7GB/T21854—XXXX——制備貯備液的方法及試液更新的頻率；若使用助溶劑，須給出其成分和濃度；——受試物加入方法（例如泵、稀釋系統(tǒng)）；——方法的回收率和配制濃度、定量限、試驗容器中實測濃度的平均值及其標準偏差，及其計算方法；——稀釋水特性：pH值、硬度、溫度、溶解氧濃度、余氯水平（若測定），總有機碳、懸浮物、試驗介質(zhì)的鹽度（若測定）以及其他測定數(shù)據(jù)；——試驗容器內(nèi)的水質(zhì)，pH、硬度、溫度和溶解氧濃度；——喂食的詳細內(nèi)容（如食物種類、來源、喂食量和喂食頻率）。d）試驗結果——對照組總存活率及是否符合該魚種的有關標準（附錄1）；——每個階段(胚胎、仔魚和稚魚)的死亡率數(shù)據(jù)和累積死亡率；——孵化開始時間、結束時間，孵化期間每天的孵化數(shù)；——試驗結束時健康魚的數(shù)量；——存活魚的長度(魚標準長或魚全長)和重量數(shù)據(jù)；——形態(tài)異常的發(fā)生率及描述；——有行為效應的發(fā)生率及描述；——統(tǒng)計分析方法(回歸分析或方差分析)和數(shù)據(jù)處理方法(使用的統(tǒng)計檢驗或模型)；——所測定的每個終點的無可觀察效應濃度（NOEC）；——所測定的每個終點的最低可觀察效應濃度（LOEC）（p＝0.05）；——評估的每個終點的ECx（如適用）和置信限（例如90%或95%）和用于計算的擬合曲線、劑量-效應曲線的斜率、回歸模型的公式、模型參數(shù)估計值及其標準誤差。e）任何與測試導則的偏離f）結果討論結果討論，對偏離測試準則的說明。當試驗溶液中所測受試物毒性濃度大小與分析方法的檢測限接近時，應謹慎解釋試驗結果。88（資料性）GB/TGB/T21854XXXX—/)OncorhynchusmykissPimephalespromelasDaniorerioOryziaslatipesGobiocyprisrarus/河口和海洋:CyprinodonvariegatusMenidiasp.（1）魚的最短體長不是有效性標準，但低于此數(shù)據(jù)，應評估受試魚的敏感性。99（2）特定品系的虹鱒魚可能需要使用其他溫度。種魚必須保持在與卵相同的溫度下。從商業(yè)購買后的魚卵，需經(jīng)短暫的溫度適應(例如1-2小時)。（3）虹鱒仔魚應在黑暗中培養(yǎng)至孵化后一周（觀察時間除外），試驗期間保持弱光（12-16h光周期）。（4）對于任何給定的測試條件，光周期恒定。GB/TGB/T21854XXXX——GB/T21854XXXX—GB/TGB/T21854XXXX—Oncorhynchusmykiss不需要dPimephalespromelasDaniorerio蛋白質(zhì)BSN1次/d;OryziaslatipesGobiocyprisrarus河口和海洋:CyprinodonvariegatusMenidiasp.a卵黃囊仔魚（或稱早期仔魚）不需食物；b混合培養(yǎng)過濾；c—GB/T21854XXXX—GB/T21854—XXXX合格稀釋水的化學特性表C.1合格稀釋水的化學特性鋁砷鉻鈷銅鐵鉛鎳鋅鎘汞銀GB/T21854—XXXXNOEC測定的統(tǒng)計導則D.1概要一個平行容器作為分析單位。因此，對于連續(xù)變量（例如尺寸），應計算平行均值或中位數(shù)，用于統(tǒng)計分析。應基于每家實驗室大量的歷史數(shù)據(jù)，獲得測試結果的有效性。對于生長毒性終點（體長和體重）應提供75-80%的有效性。在制定本文件時，基于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫并利用該統(tǒng)計方法獲得了測試結果的有效性（表D.1）。每家實驗室應開展有效性分析或證明每個終點的變異系數(shù)（CV）不超過本文件規(guī)定的CV第90百分位，以證明其滿足此有效性分析要求。如果只有平行平均值或中位數(shù)可用，則平行內(nèi)CV可以忽略。表D.1選定淡水物種的第90百分位變異系數(shù)針對毒理學研究所開展的統(tǒng)計檢驗，大多數(shù)是暴露組與對照組之間的比較。因此，在使用Dunnett或Williams檢驗之前要求顯著的ANOVAF檢驗是不合適的，在使用Jonckheere-Terpstra、Mann-Whitney或Dunn檢驗之前要求顯著的Kruskal-Wallis檢驗也是不合適的。Dunnett檢驗具有內(nèi)置的多重性調(diào)整，使用F檢驗會對其假陽性和假陰性率產(chǎn)生不利影響。類似地，在每一步使用0.05顯著性水平的step-downWilliams和Jonckheere-Terpstra檢驗保留了5%的總體假陽性率，并且使用F或Kruskal-Wallis檢驗對該比率和檢驗的有效性產(chǎn)生不利影響。Mann-Whitney和Dunn檢驗必須針對多重性進行調(diào)整，建議進行Bonferroni-Holm調(diào)整。參考文獻中對大部分的假設檢驗和驗證進行了詳細討論。D.2使用溶劑時對照組的處理如果使用溶劑，則應包括稀釋水對照和溶劑對照。應比較稀釋水對照和溶劑對照之間的差異，如果兩者之間無顯著差異，則應將兩組數(shù)據(jù)合并后用于統(tǒng)計分析。否則，應采用溶劑對照而非稀釋水對照用于NOEC測定或ECx估計。對于長度、重量、孵化率或仔魚死亡率或仔魚異常，以及孵化或游泳的起始或結束，應使用T檢驗或Mann-Whitney檢驗在0.05顯著性水平上比較稀釋水對照和溶劑對照之間的差異，并報告這些測試的結D.3尺寸測量(長度和重量)GB/T21854—XXXX單個魚體的長度和重量值可以是正態(tài)分布或?qū)?shù)正態(tài)分布。在這兩種情況下，組內(nèi)平均值往往根據(jù)中心極限定理傾向于正態(tài)分布。該結果是基于100多個對三種淡水物種的魚類胚胎急性毒性（ELS）的試驗結果。如果歷史數(shù)據(jù)表明單個魚體大小呈對數(shù)正態(tài)分布，則可以計算單個魚體的組內(nèi)平均對數(shù)，然后用于分析的數(shù)據(jù)可以是這些重復平均對數(shù)的反對數(shù)。應該評估數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布和方差齊性。為此，應使用以濃度作為單一解釋類變量的ANOVA模型的殘差?？梢允褂蒙Ⅻc圖和直方圖或莖葉圖進行分析?；蛘?，可以使用正式的測試，例如Shapiro-Wilk或Anderson-Darling?？梢酝ㄟ^對同一散點圖的可視化分析或通過Levene檢驗正式評估方差同質(zhì)性的一致性。只有參數(shù)檢驗（例如，Williams、Dunnett）需要評估正態(tài)性或方差齊性。應注意可能的異常值及其對分析的影響?？梢允褂肨ukey的異常值檢驗和對上述相同殘差圖的可視化分析。剔除離群值時應謹慎。利用試驗設計和生物學期望特征的統(tǒng)計檢驗是step-down趨勢檢驗，例如Williams和Jonckheere-Terpstra。這些檢驗假設是單調(diào)的濃度反應，并且應該評估數(shù)據(jù)與該假設的一致性。繪制測試濃度與效應的散點圖說明單調(diào)性，此外將此散點圖與加權濃度平均值與效應的線性圖重疊，可進一步說明單調(diào)性。這個分段線性圖與單調(diào)性的巨大偏差表明可能需要進行非趨勢檢驗?；蛘?，可以使用正式檢驗。一個簡單的正式檢驗是計算濃度平均值的線性和二次對比。如果二次對比度顯著而線性對比度不顯著，則表明可能存在單調(diào)性問題，應從圖中進一步評估。在正態(tài)性或方差齊性可能有問題時，這些對比可以從排序轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)中構建?？梢允褂锰娲绦?，例如Bartholomew的單調(diào)性檢驗，但會增加復雜性。圖D.1大小測量的NOEC流程圖(長度和重量)GB/T21854—XXXX虛線框圖用于孵化第一天、最后一天、仔魚的游泳*或異常行為等效應的統(tǒng)計檢驗（這些效應均不滿足參數(shù)分析或模型的假設）*除非數(shù)據(jù)與這些檢驗的要求不一致，否則NOJonckheere-Terpstra檢驗確定。參考文獻[14]提供了有關這些程序的詳細信息。對于不符合step-down趨勢檢驗要求的數(shù)據(jù)，可以使用Dunnett檢驗或Tamhane-Dunnett(T3)檢驗，這兩種檢驗都具有內(nèi)置的多重性修正。在Dunnett檢驗下，假設檢驗正態(tài)分布和方差齊性。在不滿足這些條件的情況下，可以使用Dunn的非參數(shù)檢驗。參考文獻[14]包含所有這些檢驗的詳細信息。圖D.1為檢驗選擇的流程圖。D.4卵孵化率和仔魚存活率每個重復中的卵孵化率和仔魚存活率，采用超二項式方差進行分析。圖D.2為卵孵化率和仔魚存活率檢驗流程圖。Tarone的C(α)檢驗和卡方檢驗為常用的檢驗方法，每個測試濃度可分別進行檢驗。如果在一個測試濃度中有超二項式方差，則使用合適的方法。∧其中是給定濃度平均率的估計，m是重復數(shù)，nj是第j個重復的生物數(shù)量，xj是重復中有效應的數(shù)p量，如未孵化或死亡。每個濃度分別檢驗。該檢驗可以看作是調(diào)整后的卡方檢驗，但Tarone檢驗效能要更高。圖D.2:卵孵化率和仔魚死亡率的NOEC流程圖*數(shù)據(jù)是重復比例GB/T21854—XXXX如果沒有顯著的超二項方差，則可以忽略重復使用step-downCochran-Armitage檢驗。若有顯著的超二項方差，建議使用Rao-Scott校正的Cochran-Armitage檢驗(RSCA)，此檢驗會考慮重復、重復大小和超二項方差。對尺寸測量可使用step-downWilliams和Jonckheere-Terpstra檢驗和Dunnett檢驗。無論是否存在超二項方差，這些檢驗都適用，但效能降低。D.5孵化的第一天或最后一天或游動每個重復觀察到的效應值應該是整數(shù)。在對照組的重復中不一定同一天孵化，也可能低濃度組中同一天孵化，Williams和Dunnett等參數(shù)檢驗不適用于此類數(shù)據(jù)。如有明顯單調(diào)性，使用Dunn's檢驗，否則使用step-downJonckheere-Terpstra檢驗。D.6仔魚異常統(tǒng)計仔魚異常的數(shù)量。如果數(shù)據(jù)大致呈單調(diào)性，則使用step-downJonckheere-Terpstra檢驗，否則使用Dunn's檢驗。GB/T21854—XXXX回歸估計的統(tǒng)計導則E.1概要用重復平均值（長度和重量）或重復比率（卵孵化率和仔魚死亡率）進行擬合。通常建議使用重復樣本量作為權重進行加權回歸。其他加權方案也是可行的，例如通過預測的平均效應進行加權，或者合并該效應和平均樣本大小進行加權。不建議通過濃度內(nèi)樣本方差的倒數(shù)進行加權（Bunkeetal.1999,SeberandWild,2003,MotulskyandChristopoulos2004,Huetetal.2003）。在分析之前對效應進行的任何轉(zhuǎn)換都應保持觀察的獨立性，并且ECx及其置信限應以原始測量單位而不是轉(zhuǎn)換后單位進行表示。例如，長度的對數(shù)變化20%不等于長度變化20%（Lyleset.al2008,DraperandSmith1999）。圖E.1為ECx估計的流程圖。圖E.1ECx估計重復平均長度、重量或卵孵化率或仔魚死亡率的流程圖，更多細節(jié)見正文E.2關于卵孵化率和仔魚死亡率的考慮對于卵孵化率和仔魚死亡率，通常最好擬合遞減模型，除非擬合如下所述的概率模型。也就是說，應該對未孵化的卵或死亡的仔魚的比例進行建模。其原因是ECx指的是與對照組相比，導致x%受試生物出現(xiàn)某觀察效應的受試物濃度。如果空白對照有死亡，則在計算ECx時應進行校正。E.3關于大小(長度或重量)和卵孵化率或仔魚存活率的模型。GB/T21854—XXXX除了Brain-Cousinshermetic模型，所有這些推薦的模型都在參考文獻[14]中進行了推薦。在Slob(2002)的生態(tài)毒性實驗中也討論了下述2-5模型。當然，還有許多其他可能有用的模型。作者參考大量模型，列出特別適用于生態(tài)毒性實驗并廣泛應用的模型，但不包括Bunke等人列出的模型。5個測試濃度加對照：a)Bruce-Versteegb)SimpleExponential(OECD2)c)Exponentialwithshapeparameter(OECD3)d)SimpleExponentialwithLowerBound(OECD4)6個或更多測試濃度加上對照e)Exponentialwithshapeparameterandlowerbound(OECD5)f)Michaelis-Mentong)Hillh)當有明顯的刺激效應時（不太可能在卵孵化率或仔魚存活率中體現(xiàn)，但在大小觀察中可能有效應）i)Brain-CousinsHormetic;BrainandCousens(1989)E.4卵未孵化率和仔魚死亡率的模型選擇如果沒有顯著的超二項式方差并且在模型擬合中對空白效應進行估算，則可以通過probit（或logistic）模型對這些效應進行擬合。這不是最優(yōu)方法，因為它是針對個體而不是基于重復進行的分析（Morgan1992,O'HaraHinesandLawless1993,Collett2002,2003）。E.5單一模型的擬合優(yōu)度a)直觀比較每個測試濃度下觀察到的和預測的減少百分比（MotulskyandChristopoulos2004,Draper和Smith1999）。b)使用F檢驗將回歸誤差均方與純誤差均方進行比較（Draper和Smith1999）。c)檢查模型中的每項是否與零顯著不同（即確定所有模型項是否重要MotulskyandChristopoulos2004）。d)回歸與測試濃度的殘差圖，可能取對數(shù)。該圖無固定模式，這些點應隨機散布在零水平線附近。e)附錄D評估數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。f)另外，采用附錄D中ANOVA殘差分析方法對回歸模型中殘差的正態(tài)性進行評估。E.6比較模型a)使用Akiaki的AICc標準。AICc值越小表示擬合度越好，如果AICc(B)-AICc(A)≥10，則認為模型A比模型B好（MotulskyandChristopoulos2004）。b)通過它們滿足上述單一模型標準的程度，可視化分析比較這兩個模型。c)建議使用簡約原則，使用最簡單的模型來合理擬合數(shù)據(jù)（Ratkowsky1993,Lyleset.al2008）。E.7ECx質(zhì)量評估ECx的置信限(CI)不應太寬。采用統(tǒng)計檢驗判定置信限的寬度和ECx有效性。用回歸模型對卵孵化率和大小數(shù)據(jù)進行擬合時，ECx(x=10、20或30)的75%置信限跨度不超過兩個測試濃度（OttandLongnecker2008,AlvordandRossio1993,MotulskyandChristopoulos2004,Lylesetal2008,SeberandWild2003,Bunkeetal.1999,EnvironmentCanada2005）。GB/T21854—XXXXECx（或任何其他模型參數(shù)）的CI不包括零。假設檢驗中經(jīng)常對最小顯著性差異進行分析LOEC均值效應的置信限不包含空白對照平均值。人們應該懷疑參數(shù)估計是否科學合理。例如，如果y0的置信限為±20%，則EC10的估計是不合理的。如果模型預測C濃度下的效應為20%，而在C和更低濃度下觀察到的最大效應為10%，則EC20合理（MotulskyandChristopoulos2004,Wangetal.2000,EnvironmentCanada2005）。ECx不應要求在正濃度范圍之外進行外推（DraperandSmith1999）。例如，一般指南要求ECx不能低于最低測試濃度或高于最高測試濃度的25%。GB/T21854—XXXX時間-加權平均暴露濃度計算公式F.1流水式試驗對于流水式試驗，暴露濃度的時間加權算術平均值（在測試期間已多次測定濃度）可按如下方式計………………式中：Cw——時間加權算術平均濃度；n——采樣周期；Cstart,i——第i期新試驗溶液的濃度；Cend,i——第i期舊試驗溶液的濃度；wi——時間ti–ti-1，在第i個濃度測量間隔內(nèi)的小時數(shù)或天數(shù)。F.2半靜態(tài)試驗：對于半靜態(tài)試驗，一系列對數(shù)平均值（其中每個對數(shù)平均值代表更新間隔期間的濃度）的時間加權算術平均值可按如下方式計算：………………式中：Cw——時間加權算術平均濃度；n——采樣周期Cnew,i——第i期新試驗溶液的濃度；Cold,i——第i期舊試驗溶液的濃度；wi——時間ti–ti-1，在第i個濃度測量間隔內(nèi)的小時數(shù)或天數(shù)。GB/T21854—XXXX參考文獻[1]OECD(2012),FishToxicityTestingFramework,EnvironmentalHealthandSafetyPublicationsSeriesonTestingandAssessmentNo.171,OECD,Paris.[2]OECD(2019),GuidanceDocumentonAquaticToxicityTestingofDifficultSubstancesandMixtures,EnvironmentalHealthandSafetyPublications,SeriesonTestingandAssessment.No.23,OECDParis.[3]ASTM(1988),StandardGuideforConductingEarlyLife-StageToxicityTestswithFishes.AmericanSocietyforTestingandMaterials,E1241-88.26pp.[4]Brauhn,J.L.andR.A.Schoettger(1975),AcquisitionandCultureofResearchFish:Rainbowtrout,Fatheadminnows,ChannelcatfishandBluegills,EcologicalResearchSeries,EPA-660/3-75-011,Duluth,Minnesota.[5]Brungs,W.A.andB.R.Jones(1977),TemperatureCriteriaforFreshwaterFish:ProtocolandProcedures,EcologicalResearchSeriesEPA-600/3-77-061,Duluth,Minnesota.[6]Adolfsson-Erici,etal.(2012),Aflow-throughpassivedosingsystemforcontinuouslysupplyingaqueoussolutionsofhydrophobicchemicalstobioconcentrationandaquatictoxicitytests,Chemosphere86,593-599.[7]Hutchinson,T.H.etal.(2006),Acuteandchroniceffectsofcarriersolventsinaquaticorganisms:Acriticalreview,AquaticToxicology,76,69-92.[8]OECD(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