DB32T 4539-2023 淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術方法　　

淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術方法發(fā)出布版發(fā)出布版江蘇省市場監(jiān)督管理局Ⅰ前言 Ⅲ 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4監(jiān)測點位布設 5監(jiān)測頻次與時間 6試劑和材料 7儀器和設備 8環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測內(nèi)容和方法 9質(zhì)量控制與質(zhì)量保證 10廢棄物處理 附錄A（資料性）環(huán)境DNA固定劑 附錄B（資料性）常用淡水生物DNA條形碼擴增引物信息 附錄C（規(guī)范性）淡水生物DNA條形碼構(gòu)建方法 附錄D（資料性）生物統(tǒng)計表 附錄E（規(guī)范性）野外質(zhì)量控制與保證 附錄F（規(guī)范性）實驗室質(zhì)量控制與保證 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省生態(tài)環(huán)境廳提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心、南京大學。1DB32/T4539—2023淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術方法本文件規(guī)定了利用環(huán)境DNA技術監(jiān)測淡水生物的采樣、試劑和材料、儀器和設備、監(jiān)測內(nèi)容和步驟，以及質(zhì)量控制與保證。本文件適用于生態(tài)環(huán)境監(jiān)測領域湖泊、水庫、溪流、河流、河口區(qū)等水域浮游植物、浮游動物、著生藻類、大型底棲無脊椎動物和魚類等淡水生物物種組成及相對豐度的監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T20001.4標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準GB/T29859生物信息學術語GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程GB/T34265Sanger法測序技術指南GB/T35890高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范GB/T37874核酸提取純化方法評價通則GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術規(guī)范HJ494水質(zhì)采樣技術指導HJ710.7生物多樣性觀測技術導則內(nèi)陸水域魚類HJ710.8生物多樣性觀測技術導則淡水底棲大型無脊椎動物HJ1216水質(zhì)浮游植物的測定0.1ml計數(shù)框?顯微鏡計數(shù)法HJ1295水生態(tài)監(jiān)測技術指南河流水生生物監(jiān)測與評價（試行）HJ1296水生態(tài)監(jiān)測技術指南湖泊和水庫水生生物監(jiān)測與評價（試行）SC/T9402淡水浮游生物調(diào)查技術規(guī)范SN/T4835實驗室生物廢棄物管理要求DB21/T2777海洋浮游微藻分離和篩選技術規(guī)程DB32/T4178河流水生態(tài)監(jiān)測規(guī)范3術語和定義GB/T20001.4、GB/T29859和GB/T30989界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1淡水生物freshwaterorganisms生活在各類淡水生境中的生物。2DB32/T4539—2023注：主要的淡水生物類群包括浮游植物、浮游動物、大型底棲無脊椎動物和魚類等。3.2環(huán)境DNAenvironmentalDNA；eDNA環(huán)境介質(zhì)（水、土壤、沉積物、生物膜、空氣等）或混合生物組織中存在的脫氧核糖核酸（DNA）等生物遺傳物質(zhì)。3.3DNA條形碼DNAbarcode生物體細胞核或者細胞器中能夠代表該物種的、有足夠變異的、易擴增的短DNA序列，可用于物種的識別和鑒定。[來源：SN/T4278—2015，3.1，有修改]3.4引物primer在DNA復制過程中，結(jié)合于模板鏈上并提供DNA合成起點，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。3.5聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction；PCR一種體外酶促合成特異DNA片段的分子技術，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便省時等特點。3.6Sanger測序Sangersequencing用于基因測序的雙脫氧末端終止法，在鏈延伸過程中利用熒光標記雙脫氧堿基隨機阻斷，產(chǎn)生以A/T/G/C結(jié)束的四組不同長度的核苷酸鏈，通過讀取熒光信號實現(xiàn)對核酸堿基序列信息的讀取。3.7遺傳距離geneticdistance群或分類單元間的遺傳差異程度，可以通過遺傳標記如DNA條形碼的序列差異來表示。3.8高通量測序high?throughputsequencing區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger（雙脫氧鏈末端終止法）測序，能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術。[來源：GB/T30989—2014，3.19，有修改]3.916S核糖體DNA16SribosomalDNA；16SrDNA原核生物編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列。3.1018S核糖體DNA18SribosomalDNA；18SrDNA真核生物編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列。3.11線粒體12S核糖體DNAmitochondrial12SribosomalDNA；Mt12SrDNA后生動物線粒體編碼12SrRNA的DNA序列。3.12線粒體細胞色素c氧化酶ImitochondrialcytochromecoxidaseI；COI后生動物線粒體編碼細胞色素c氧化酶I的DNA序列。3.13DNA宏條形碼DNAmetabarcoding利用高通量測序獲取環(huán)境DNA中特定的DNA片段，根據(jù)DNA序列差異識別物種，獲取物種組成3和群落結(jié)構(gòu)。標簽tag通過PCR或文庫準備過程中為每個樣品添加一個短序列的核苷酸堿基對，允許多個樣品在一個高通量測序運行中被匯集。注：這個序列對于同一個運行中的每個樣本都是不同的，并使序列能夠在測序后分配回它們來自的樣本。序列相似性sequencesimilarity反映序列間相似程度的數(shù)值，即序列間相同DNA堿基數(shù)目所占的比例。注：一般以百分數(shù)表示。序列相似性閾值cutoffvalueofsequencesimilarity判定兩條DNA序列是否為同一分類單元的最小序列相似值。擴增序列變體ampliconsequencevDNA宏條形碼技術中，通過生物信息學剔除PCR擴增和測序產(chǎn)生的錯誤序列后形成的獨特DNA序列，即任意兩條序列間至少有一個堿基存在差異。操作分類單元operationaltaxonomicunit；OTUDNA宏條形碼測序數(shù)據(jù)按照一定的序列相似性閾值進行聚類，獲得的用于表征物種的分子水平分類單元。相對豐度relativeabundance樣品中分配到某一分類單元的序列數(shù)占該樣品序列總數(shù)的比例。陰性質(zhì)控樣本negativecontrolsample確定不含特定物種或者所有物種的樣本（例如無菌水與待測樣本同步試驗，用于判斷待測樣本是否被污染。陽性質(zhì)控樣本positivecontrolsample已確定物種組成的樣本，與待測樣本同步試驗，用于判斷測序結(jié)果是否可靠。4監(jiān)測點位布設按照HJ91.2設置環(huán)境DNA采樣點位，應遵循連續(xù)性、一致性、代表性和可行性原則。結(jié)合環(huán)境DNA的時空分布特征，綜合考慮監(jiān)測類群的生態(tài)和生活史特征、水體類型、大小、深度、分層、連通性、基質(zhì)、溫度、水文和水化學等因素的影響。注：生活污水中可能含有殘留的生物DNA，采樣位點布設要盡量避免污水排放渠和污水處理廠，并詳實記錄。44.2溪流、河流點位布設按照HJ1295的規(guī)定設置監(jiān)測斷面，每個斷面設置不少于3個代表性點位。在緩慢流動的低地溪流和河流中，宜間隔1km設置采樣點。在快速流動的高山溪流和河流中，采樣位點宜間隔10km以上。DNA擴散的因素。4.3湖泊、水庫監(jiān)測點位布設按照HJ1296的規(guī)定設置監(jiān)測點位，大型湖泊應適當增加監(jiān)測點位。湖庫構(gòu)成湖庫群，當對區(qū)域湖庫作整體監(jiān)測時，可適當減少單個湖庫的監(jiān)測點位。宜設置湖庫監(jiān)測點位周邊100m的范圍內(nèi)為采樣區(qū)域。深水型湖泊宜間隔5m深度分層采樣。5監(jiān)測頻次與時間5.1監(jiān)測頻次綜合考慮水域環(huán)境條件、生物類群的時空分布特點、監(jiān)測目的及人力、費用投入，確定監(jiān)測頻次?？蛇x擇季度或月度開展監(jiān)測，應避開雨水集中的時間。針對重點關注區(qū)域、突發(fā)環(huán)境問題或其他條件下，可開展更高頻次的監(jiān)測。5.2監(jiān)測時間采樣時間宜綜合考慮靶向監(jiān)測類群的生態(tài)特征和生活史及水體類型。例如：湖泊、水庫，宜考慮生物類群的季節(jié)性分層；溪流、河流，宜考慮遷移物種的分布模式（如魚類洄游）。6試劑和材料6.1超純水。6.2分析純無水乙醇。6.3環(huán)境DNA固定劑，可參考附錄A。6.4DNA提取試劑盒或CTAB法提取DNA所用到的試劑。6.5PCR擴增試劑：用于特異性片段PCR擴增，通常包含緩沖液、擴增酶等。6.6PCR擴增引物：可參考附錄B。6.7PCR產(chǎn)物純化試劑盒：用于PCR產(chǎn)物純化。6.8DNA濃度測定試劑：用于DNA濃度測定，主要成分包括緩沖液和染色劑。6.9凝膠電泳相關試劑：用于PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測，通常包含瓊脂糖、電泳緩沖液（TAE）、片段大小標記。6.10文庫構(gòu)建試劑：用于樣品的基因文庫構(gòu)建，試劑盒內(nèi)至少應包含末端修復酶、測序接頭、DNA連接6.11高通量測序試劑：用于對測序文庫進行高通量基因測序，試劑盒內(nèi)至少應包含測序引物、測序反應6.12無菌采樣瓶或采樣袋：1L及以上規(guī)格。6.14無菌鑷子。56.18PCR管、96孔板等類似的PCR反應容器：無DNA和生物殘留。6.19無菌手套。7儀器和設備7.1恒溫水浴鍋。7.2渦旋振蕩器或均質(zhì)儀。7.3冷凍干燥儀。7.4真空離心濃縮儀。7.5高速冷凍離心機：離心轉(zhuǎn)速可達13000r/min，溫控范圍低至4℃。7.6微量移液器：0.5μL~10μL、20μL~200μL和100μL~1000μL等。7.8PCR儀。7.9電子天平。7.10水平式核酸電泳儀。7.11凝膠成像分析儀。7.12高通量測序儀。7.13高溫高壓滅菌器：可達到標準要求的121℃、21m7.17大型底棲無脊椎動物采集裝置：如彼得森采泥器、D型抄網(wǎng)、踢網(wǎng)、索伯網(wǎng)等。7.18水樣抽濾設備：具備-91.2kPa以上的真空抽濾設備。7.19大型底棲無脊椎動物清洗裝置：如40目篩網(wǎng)等。7.20超凈工作臺。7.21低溫存儲設備：普通冰箱、低溫冰箱和超低溫冰箱。7.22液氮罐。7.23工作站：運行內(nèi)存不低于16GB，硬盤存儲不低于1TB，處理器不低于8核。7.24高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和分析軟件。8環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測內(nèi)容和方法8.1環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測內(nèi)容環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測包括環(huán)境DNA樣品采集、環(huán)境DNA提取、宏條形碼擴增與測序、生物信息學分析、生物統(tǒng)計表和質(zhì)量控制與質(zhì)量保證等過程（見圖1）。6圖1環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測技術流程根據(jù)監(jiān)測的生物類群，按照表1選擇合適的環(huán)境DNA采集方法，每個位點采集3個生物重復樣品。表1不同生物類群的環(huán)境DNA采樣介質(zhì)十十十十十十十注：十表示可用，十+表示較多采用，++十表示最為常用。大型底棲無脊椎動物主要通過采集沉積物中底棲動物組織，進一步通過乙醇浸提法獲取組織DNA。水樣采集按照HJ494的規(guī)定執(zhí)行，采樣體積不宜小于1L。浮游植物監(jiān)測的水樣體積宜為1L,底棲動物和魚類監(jiān)測的水樣體積宜為3L?，F(xiàn)場過濾至一定孔徑(一般為0.45μm)的濾膜上，高泥沙水樣，應低溫(4℃或冰袋保存)靜置分離懸浮顆粒物，再過濾。生物密度較高的水體(如處于藻華爆發(fā)期),可將水樣等體積分開過濾至多張(1~5)濾膜作為子樣本。野外干冰、液氮或-20℃保存，實驗室-20℃以下保存；或者加入附錄A推薦的固定劑，常溫保存。按照HJ494的規(guī)定采集50mL的積生物殘體，收集至無菌管中，同一采樣點沉積物采集宜涵蓋各類小生境(如沉水植被覆蓋區(qū)等)。野外干冰或-20℃保存，實驗室-20℃保存；或者加入無水乙醇，確保樣品中最終的乙醇濃度≥80%,低溫7保存。8.2.4生物膜樣品按照DB32/T4178的規(guī)定從不同自然基質(zhì)（如粗礫石、鵝卵石以及樹木殘干等）表面刮取25cm2樣品，無菌水清洗至采樣瓶中，野外干冰或-20℃保存，實驗室-20℃保存；或者加入無水乙醇，確保最終的乙醇體積分數(shù)≥80%，低溫保存。8.2.5混合生物組織樣品8.2.5.1按照SC/T9402的規(guī)定用浮游生物網(wǎng)定量采集浮游動物樣品，采樣體積不小于20L，過濾至5μm孔徑濾膜，野外干冰保存，實驗室-20℃保存；或者加入附錄A推薦的固定劑，常溫保存。8.2.5.2大型底棲無脊椎動物采集與篩選應按照HJ710.8，加入3倍體積的無水乙醇，1g換算為1mL，常溫保存。8.3環(huán)境DNA樣品前處理8.3.1濾膜樣品（水樣/混合浮游動物組織樣品利用研磨珠和裂解液將濾膜振蕩破碎。8.3.2沉積物樣品：乙醇保存的樣品應高速（不低于12000r/min）離心20min，留取沉淀物。低溫保存的樣品可經(jīng)均質(zhì)儀均質(zhì)后冷凍干燥，充分混勻。淀物。8.3.4混合底棲動物組織樣品：室溫放置5d，多次振蕩混勻，吸取浸出液，真空離心濃縮至乙醇完全去除。8.4環(huán)境DNA提取按照GB/T40226中的操作步驟，借助物理和化學方法充分釋放環(huán)境介質(zhì)中蘊含的DNA，并去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂類、多糖、RNA等雜質(zhì)，采用離心柱法和磁珠法等常規(guī)分子生物學操作純化DNA。8.4.2DNA濃度測定與保存波長處的吸光度值比值（OD260nm/OD280nm）應在1.7~2.0范圍內(nèi)，OD260nm/OD230nm應大于2.0。DNA平行分裝后，應在—20℃及以下溫度條件保存，避免反復凍融。8.5宏條形碼擴增與測序8.5.1宏條形碼擴增8.5.1.1針對不同生物類群選擇特異性一對或多對引物擴增目標條形碼序列，可在引物序列前添加標簽以區(qū)分樣品。推薦引物參照附錄B。8.5.1.2宏條形碼產(chǎn)物用1%~2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，應呈現(xiàn)單一清晰明亮、無拖尾的條帶。若樣品出現(xiàn)多個條帶，需純化PCR產(chǎn)物，純化過程參考SN/T4278。8.5.1.3條形碼擴增產(chǎn)物在-20℃及以下保存，保存時間一般不超過1年。88.5.2高通量測序8.5.2.1宜將含有不同的引物標簽的宏條形碼擴增產(chǎn)物等摩爾量混合構(gòu)建測序文庫。文庫構(gòu)建起始量應不低于100ng。當文庫的片段長度分布符合預期，且文庫濃度滿足高通量測序要求時，文庫質(zhì)檢合格。8.5.2.2將多個質(zhì)檢合格的文庫按比例混合，參考GB/T30989和GB/T35537對宏條形碼擴增產(chǎn)物進行測序。同一試驗樣本宜安排在同一批次上機測序。每個樣本的預期的有效序列數(shù)不宜低于30000條。8.6生物信息學分析8.6.1一般要求同一批試驗數(shù)據(jù)，生物信息學分析流程及關鍵參數(shù)應保持一致。8.6.2序列質(zhì)量控制雙端測序應進行序列合并。通過搜索特定序列（去除測序接頭adaptor、樣品標簽tag和引物并基于堿基識別質(zhì)量（>Q20，參考）和序列長度（>預期長度的70%，參考）進行序列修剪，確保前端序列長度+后端序列長度?兩段序列的重疊長度（overlap）≥目標序列長度。8.6.3文庫拆分根據(jù)每個樣品的標簽將序列分配到不同的樣品中。8.6.4序列聚類及質(zhì)量控制8.6.4.1可選用OTU或ASV方法進行序列聚類和或降噪，獲得分子分類單元，并過濾掉非目標序列。8.6.4.2OTU方法：將相似性大于或等于閾值（相似性閾值一般為97%）的序列合并成OTUs，將序列比對到每個OTU的代表性序列，獲得每個OTU在每個樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。8.6.4.3ASV方法：每個獨特的序列即為一個ASV，根據(jù)生物信息學方法過濾潛在的PCR和測序錯誤的ASV序列，將序列比對到每個ASV，獲得每個ASV在每個樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。8.6.5過濾低豐度的分子分類單元過濾低豐度（如總序列數(shù)為1~5，可能為假陽性、污染序列或未去除的嵌合體）和陰性對照中相對序列豐度超過千分之一的分子分類單元，也可根據(jù)實際監(jiān)測需求調(diào)整過濾的豐度閾值。注：嵌合體為PCR擴增中產(chǎn)生的由兩種或兩種以上序列母體組合的錯誤序列。8.6.6物種注釋將分子分類單元的序列與條形碼數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得物種注釋信息。物種注釋方法和物種鑒定閾值（主要是序列相似性）的選擇，宜綜合考慮選用的條形碼片段、參考數(shù)據(jù)庫的完整性及數(shù)據(jù)用途。當參考數(shù)據(jù)庫中不存在目標物種的DNA序列時，按照附錄C構(gòu)建DNA條形碼。8.7結(jié)果統(tǒng)計8.7.1檢出判定分子分類單元在某一位點的生物重復樣品中檢出率（物種檢出的樣品數(shù)除以總樣品數(shù)）不應低于2/3。建議每個樣品宜保留相對豐度>0.01%，出現(xiàn)在兩個樣點以上的分子分類單元。98.7.2序列相對豐度每個位點檢出的分子分類單元的序列相對豐度應為所有生物重復樣品中序列相對豐度的平均值。針對相對豐度差異較大的生物重復，宜取幾何平均數(shù)。8.7.3生物統(tǒng)計表每個樣品的生物多樣性統(tǒng)計表由分子分類單元（如ASVs或OTUs）名稱、序列、物種注釋信息、序列數(shù)和相對豐度組成，可參考附錄D。9質(zhì)量控制與質(zhì)量保證9.1質(zhì)量控制9.1.1質(zhì)量控制參數(shù)9.1.1.1陰性對照在每天的樣品采集、同一批次DNA提取和PCR擴增階段應分別設置不少于3個陰性對照，高通量測序時可適當設置1~3個測序的陰性對照（見表2）。表2環(huán)境DNA宏條形碼技術每個流程設置的陰性和陽性對照操作過程陰性質(zhì)控樣本陽性質(zhì)控樣本過濾無菌水無DNA提取無菌水已知組成的混合群落PCR擴增無菌水已知物種組成的DNA標準樣品測序無菌水測序試劑盒中的對照試劑9.1.1.2陽性對照宜設置不少于6個PCR擴增的陽性對照。PCR擴增的陽性對照應為不少于5個物種的基因組DNA（已知可以有效擴增）的等量混合物，質(zhì)量濃度一般為1ng/μL。也可根據(jù)試驗需要和試驗條件在DNA提取和測序過程中適當設置陽性對照（見表2）。9.1.1.3平行樣品每個位點應設置至少3個生物重復樣品，可根據(jù)試驗需求和試驗條件適當設置DNA提取、PCR和建庫測序平行樣品。平行樣品的相對豐度取平均值作為位點的相對豐度。9.1.2質(zhì)量控制評價指標9.1.2.1假陰性率使用PCR擴增的陽性對照評估監(jiān)測的假陰性率。重復測定6次，計算標準樣品中含有但測量結(jié)果中未檢出的物種所占比例，即假陰性率（FN）。假陰性率不應超過10%。按照公式（1）計算。FN=n1n…………（1）式中：FN——假陰性率；1——標準樣品中未被測出的物種數(shù)目，單位為個；n——標準樣品的實際物種數(shù)目，單位為個。9.1.2.2假陽性率使用PCR擴增的陽性對照評估監(jiān)測的假陽性率。重復測定6次，計算測量結(jié)果的中標準樣品中未包含物種的出現(xiàn)概率，即假陽性率（FP）。假陽性率不應超過10%。按照公式（2）計算。FP=n2n…………（1）式中：FP——假陽性率；2——未在標準樣品物種清單的物種數(shù)目，單位為個；n——標準樣品的實際物種數(shù)目，單位為個。9.2質(zhì)量保證9.2.1野外質(zhì)量保證按照附錄E的規(guī)定做好野外樣品采集、運輸與保存，防止樣品的交叉污染。9.2.2實驗室質(zhì)量保證試驗過程應防止樣品的污染，并按照附錄F的規(guī)定做好數(shù)據(jù)記錄和樣品保存。10廢棄物處理廢棄物的分類、收集、存放和集中處理應按照GB19489和SN/T4835的規(guī)定執(zhí)行，其中生物廢棄物在處理之前應采用高壓滅菌、消毒或灼燒等方式滅活，對含核酸染料的廢液和廢膠單獨收集和處理。DB32/T4539—2023（資料性）環(huán)境DNA固定劑A.1乙醇固定劑乙醇的體積分數(shù)不小于96%，且其中不含甲醇等其他醇類。固定劑需浸沒整個樣本，樣本在乙醇中可以在常溫下穩(wěn)定儲存3個月~6個月。乙醇保存樣本不可在—10℃以下儲存。A.2Longmire’s固定劑Longmire’s固定劑應浸沒整個樣本。常溫下，樣本在Longmire’s中可以穩(wěn)定儲存2周~6周。Long?mire’s固定劑在低溫下可能會出現(xiàn)沉淀，可適當加熱待沉淀溶解再使用。Longmire’s固定劑配方見表A.1。表A.1Longmire’s固定劑配方序號成分濃度體積1Tris?HCl1mol/L100mL2EDTA0.5mol/L200mL3NaCl4mol/L2.5mL4SDS—定容雙蒸水—1LDB32/T4539—2023（資料性）常用淡水生物DNA條形碼擴增引物信息常用淡水生物DNA條形碼擴增引物信息如表B.1所列。表B.1常用淡水生物DNA條形碼擴增引物信息目標群落基因名稱引物名稱預期長度bp退火溫度℃藍藻門16S_V316S_341FACCTACGGGRSGCWGCAG100~20055~6216S_518RATTACCGCGGCTGCTGG16S_V416S_515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA~30055~6216S_806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT16S_V3_V416S_338FACTCCTACGGGAGGCAGCAG400~50055~6216S_806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT23Sp23SrV_f1GGACAGAAAGACCCTATGAA400~45049~52p23SrV_r1TCAGCCTGTTATCCCTAGAG真核藻類18S_V918S_1389FTCCCTGCCHTTTGTACACAC100~20055~6218S_1510RCCTTCYGCAGGTTCACCTAC18S_V4TAReuk454FWD1CCAGCASCYGCGGTAATTCC300~40055~62TAReukREV3ACTTTCGTTCTTGATYRA著生硅藻18S_V4DIV4_FGCGGTAATTCCAGCTCCAATAG400~50048~55DIV4_RCTCTGACAATGGAATACGAATA浮游動物大型底棲無脊椎動物COI?1mlCOIintFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC~31345~55dgHCO2198TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA大型底棲無脊椎動物COI?2mlCOIintFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC~31345~55jgHCO2198TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA魚類Mt12SrD?NA?1MetafishF1TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA150~20060~63MetafishR1ATAGTGGGGTATCTAATCCCAGMt12SrD?NA?2Teleo_FACACCGCCCGTCACTCT~10055~60Teleo_RCTTCCGGTACACTTACCATGMt12SrD?NA?3Tele02_FAAACTCGTGCCAGCCACC150~20055~60Tele02_RGGGTATCTAATCCCAGTTTGDB32/T4539—2023表B.1常用淡水生物DNA條形碼擴增引物信息（續(xù)）目標群落基因名稱引物名稱預期長度bp退火溫度℃魚類Mt12SrD?NA?4Mifish_U_FGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC150~20055~60Mifish_U_RCATAGTGGGGTATCTA?ATCCCAGTTTGMt16SrD?NAFish16S_FGGTCGCCCCAACCRAAG~10055~60Fish16S_RCGAGAAGACCCTWTGGAGCTTIAG簡并堿基代碼：MA/C）、VA/C/G）、RA/G）、HA/C/T）、WA/T）、DA/G/T）、SC/G）、BC/G/T）、YC/T）、NA/G/C/T）、KG/T）。（規(guī)范性）淡水生物DNA條形碼構(gòu)建方法C.1DNA條形碼構(gòu)建流程當參考數(shù)據(jù)庫中不存在目標物種的DNA序列時，按照本附錄構(gòu)建DNA條形碼。水生生物DNA條形碼構(gòu)建流程主要包括物種鑒定、條形碼擴增與測序、條形碼評估和條形碼入庫等過程。C.2樣品采集和物種鑒定C.2.1浮游植物的定性樣品采集、保存與鑒定應按照HJ1216的規(guī)定執(zhí)行，浮游植物的分離培養(yǎng)按照DB21/T2777的規(guī)定執(zhí)行。C.2.2浮游動物的定性樣品采集與鑒定應按照SC/T9402的規(guī)定執(zhí)行，加乙醇溶液固定（乙醇體積分數(shù)≥90%常溫保存。C.2.3大型底棲無脊椎動物的定性樣品采集與鑒定應按照HJ710.8的規(guī)定執(zhí)行，加乙醇溶液固定（乙醇體積分數(shù)≥90%常溫保存。C.2.4魚類樣品采集與鑒定應按照HJ710.7的規(guī)定執(zhí)行，野外干冰或-20℃保存，實驗室-20℃保存；或加乙醇溶液固定（乙醇體積分數(shù)≥90%常溫保存。C.2.5浮游動物、大型底棲無脊椎動物和魚類的每個物種個體數(shù)不宜少于5個（株浮游植物和著生藻類的純培養(yǎng)藻種樣品數(shù)不宜少于5個。C.2.6形態(tài)學鑒定應由三名具有豐富鑒定經(jīng)驗的專業(yè)人員獨立完成后匯總，結(jié)果不一致的重新鑒定，并保留憑證標本。C.3條形碼擴增與測序C.3.1DNA提取和濃度及純度測定C.3.1.1常用DNA提取方法包括離心柱法和磁珠法。選取完整個體或合適部位的組織提取DNA，避免外源污染。植物和動物組織DNA的提取分別參考LY/T3191和SN/T4278。C.3.1.2按GB/T37874的規(guī)定評價提取的DNA濃度和純度，一般要求濃度不低于1ng/μL，在260nm和280nm波長處的吸光度值比值（OD260nm/OD280nm）應在1.7~1.9范圍內(nèi)，OD260nm/OD230nm應>2.0。有效的DNA樣品分裝為兩份，一份在-80℃長期保存，另一份保存在-20℃用于后續(xù)試驗，避免反復凍融。C.3.2條形碼擴增與檢測C.3.2.2針對不同生物類群選擇引物擴增目標DNA條形碼序列，常用PCR擴增引物和擴增反應條件參照表B.1。C.3.2.2PCR擴增產(chǎn)物通過1%~2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的有效性，應在目標長度位置出現(xiàn)一條單一的條帶。若樣品出現(xiàn)多個條帶，需純化PCR產(chǎn)物。具體過程參考SN/T4278。C.3.3測序使用Sanger法測序儀或第二代高通量測序儀對目標條帶進行測序。為減少Sanger法測序出現(xiàn)雙峰DB32/T4539—2023或者測序失敗，可以先將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中再進行測序。第二代高通量測序可為每個樣本提供不少于1000條高質(zhì)量序列。Sanger法測序要求參考GB/T34265，高通量測序要求參考GB/T30989和GB/T35537。C.4條形碼評估C.4.1序列質(zhì)量控制將一代測序雙端測序文件進行拼接，按照GB/T34265去除測序結(jié)果兩端的低質(zhì)量序列，序列方向應與PCR擴增正向引物方向一致。第二代高通量測序通常保留數(shù)量最多的序列，去除擴增引物，保證序列方向與PCR擴增正向引物方向一致。Sanger測序和高通量測序分別達到QV20和Q20。C.4.2遺傳距離分析C.4.2.1將有效的樣本序列合并整理成FASTA格式的文件，采用ClustalW、Muscle等方法進行多序列核苷酸或氨基酸密碼子比對，檢查蛋白編碼基因是否存在終止密碼子，并修剪對齊雙端序列。遺傳距離計算基于有差異的核苷酸位點在序列中所占的比例，同時需要考慮4種核苷酸的發(fā)生頻率和核苷酸替換類型。遺傳距離計算模型包括p距離模型、Jukes?Cantor模型和Kimura兩參數(shù)（K2P）模型，一般采用K2P模型。C.4.2.2p距離模型：利用兩個同源基因DNA序列間的核苷酸差異數(shù)所占的比例來表示基因間的分歧度。C.4.2.3Jukes?Cantor模型：本模型假定4種核苷酸之間相互隨機替代，即某一核苷酸替代變成其他3種核苷酸的概率是等同的。C.4.2.4Kimura兩參數(shù)模型：本模型將核苷酸替代分成轉(zhuǎn)換替代和顛換替代，其中轉(zhuǎn)換指A、G間替代或T、C間替代。顛換指A和T/C間的替代或G和T/C間的替代。根據(jù)實際監(jiān)測數(shù)據(jù)，核苷酸的轉(zhuǎn)換替代率約為顛換替代率的2倍，該方法可以更加真實地反映核苷酸序列間的差異。C.4.3條形碼有效性成功的物種條形碼應同時滿足以下條件：（1）陰性對照PCR無條帶；（2）陽性對照的PCR產(chǎn)物在預期的DNA條形碼序列長度位置出現(xiàn)目的條帶；（3）同一個樣本Sanger測序獲得的序列相似性≥99%；（4）同一個樣本高通量測序獲得的第一優(yōu)勢序列占比≥90%；（5）種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間距離（一般5~10倍）。C.5物種條形碼入庫成功的物種條形碼相關信息導入DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。DNA條形碼由樣本信息、DNA條形碼信息、分類信息構(gòu)成。樣本信息庫包括完整的樣本采集和鑒定信息，即樣本編號、憑證標本存放地、采樣信息、分類信息、鑒定者、數(shù)張樣本照片等。DNA條形碼信息包括每個樣本擴增采用的引物，DNA序列及基本信息統(tǒng)計。DNA條形碼信息表格可參考表C.1。表C.1DNA條形碼信息表樣本編號樣本照片采樣位點采樣人/單位采樣時間經(jīng)緯度海拔溫度鑒定人/單位鑒定時間分類特征中文名拉丁名分類信息（門綱目科屬種）DNA條形碼引物信息□16S□18S□COI□線粒體12S□其他：GC含量序列長度測序平臺序列序列原始峰圖C.6質(zhì)量控制和安全管理C.6.1嚴格按標準要求進行信息采集，填寫各項數(shù)據(jù)記錄。記錄表格編頁裝訂成冊，內(nèi)容齊全，填寫翔實，字跡工整、清晰。原始數(shù)據(jù)記錄表、圖片、樣品和分類憑證標本應及時保存歸檔，并及時填寫和歸檔電子數(shù)據(jù)（包括數(shù)據(jù)記錄表和數(shù)碼圖片等）。C.6.2采樣完成后，將所有樣品運回實驗室，與實驗室人員交接，填寫實驗室樣品記錄表。將樣品瓶上的所有信息抄寫在實驗室樣品登記表上，按照采樣區(qū)域或樣點對樣品登記表進行統(tǒng)一編號。C.6.3試驗場所應具備分子生物學實驗室的基本條件。C.6.4為防止外源污染，試驗前應將試驗用具進行高壓滅菌，并用75%乙醇擦洗表面。C.6.5DNA提取陰性對照（negativeisolationcontrol，NIC用于監(jiān)控DNA提取過程中的污染：在DNA提取過程中設置一個空管，和樣品同步操作。C.6.6PCR擴增陰性對照（negativeamplificationcontrol，NAC用于排除PCR反應混合物制備過程中由于污染造成的假陽性：用無菌水替代DNA樣品進行同步PCR擴增。C.6.7PCR擴增效率的陽性對照（positiveamplificationcontrol，PAC添加等體積已知濃度的靶向生物的基因組DNA，同步進行PCR擴增。（資料性）生物統(tǒng)計表淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測生物統(tǒng)計表見表D.1。表D.1淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測生物統(tǒng)計表檢測單位點位名稱樣品采集日期樣品處理日期測序日期測序引物分子分類單元編號序列門綱目科屬種序列數(shù)相對豐度（規(guī)范性）野外質(zhì)量控制與保證E.1樣品的采集E.1.1制定合理的采樣操作程序，在確定的采樣時間、采樣點、采樣層次，用符合質(zhì)量要求的統(tǒng)一設備采樣，采水量或采泥量盡量保持一致，以保證采集的樣品具有代表性和可比性。E.1.2保證所有野外設備處于良好的運行狀態(tài)，應制定一項常規(guī)檢查、維護及/或校準的計劃，以確保野外數(shù)據(jù)的異質(zhì)性和質(zhì)量。E.1.3合理安排各類生物樣品采集順序，盡量避免生物類群在采集前受到較大擾動。E.1.4正確填寫樣品標簽，包括樣品編號、日期、水體名稱、采樣位置以及采集人姓名。E.1.5及時在現(xiàn)場處理樣品。受生物活動影響，隨時間變化明顯的項目應在規(guī)定時間內(nèi)測定。E.1.6水樣采集后應選用冰袋或4℃短暫保存，并在12h內(nèi)完成過濾。E.1.7整個采樣和前處理過程應保持無外源污染，并符合以下要求。a）應全程佩戴無菌實驗手套，采集下一個樣品應及時更換手套。建議佩戴口罩。b）采樣和前處理過程宜采用一次性無菌裝置或耗材。對于重復使用裝置和耗材，應選用1.5%的次氯酸鈉消毒不少于1min。c）重復使用的采樣瓶，應浸泡在1.5%的次氯酸鈉中不少于5min，用蒸餾水重復沖洗3次，并晾干。在采樣點，再次用水樣沖洗三次，在采集樣品前應除去任何殘留的次氯酸鈉。確保清洗后丟棄的水樣未與待取的水樣混合。d）應只從外部接觸采樣瓶，不應接觸采樣瓶及瓶蓋內(nèi)部。e）如果有必要進入水中采樣，應使用膠靴，并在采樣點之間進行消毒。清除鞋底和靴子兩側(cè)的所有污垢、鵝卵石和其他環(huán)境碎屑。f）水樣過濾前，不應讓手套接觸被污染的表面，如任何未消毒的設備。若接觸，應及時更換手套。g）過濾每個位點的水樣前，過濾器接觸面應使用漂白劑消毒不少于1min，并用蒸餾水反復沖洗3次。E.2采樣記錄除了樣品相關信息，采樣時間、地點、水溫、氣溫、水文、植被等也應有詳細記錄，確保采樣現(xiàn)場數(shù)據(jù)的完整性。E.3樣品的運輸E.3.1應根據(jù)采樣記錄或登記表核對清點樣品，以免有誤或丟失。E.3.2樣品運輸中貯存溫度不超過采樣時的溫度，必要時需準備冷藏設備。E.3.3運輸中應仔細保管樣品，以確保樣品無破損、無污染。應避免強光照射及強烈震動。E.3.4不同介質(zhì)來源的環(huán)境DNA樣品應單獨保存運輸。E.3.5樣品的運輸盡量迅速。（規(guī)范性）實驗室質(zhì)量控制與保證F.1實驗室要求F.1.1DNA提取實驗室和PCR實驗室應在物理空間上相互獨立，不應有空氣的直接相通。F.1.2PCR實驗室應配備紫外線超凈工作臺。F.1.3每個實驗室應配備專用的實驗工作服，并定期清洗。F.2基本操作要求F.2.1實驗人員不應在同一天進行DNA提取和PCR擴增試驗。F.2.2確保所有儀器和設備處于良好的工作狀態(tài)，重要儀器（如PCR儀、離心機、冰箱和移液槍）應進行定期校準和維護。F.2.3確保所有的試驗耗材和試劑在保質(zhì)期內(nèi)，在正確的pH值下，可適當?shù)剡M行高壓蒸汽滅菌。F.2.4試驗耗材（如槍頭、離心管和PCR管等）應進行高壓蒸汽滅菌。F.2.5試驗操作前，應用1.5%的消毒劑擦拭桌面，用75%乙醇消毒雙手，用1.5%的消毒劑消毒實驗儀器。F.2.6試驗操作前，移液槍應選用75%的酒精消毒或紫外線消毒30min。F.2.7試驗過程中，實驗人員應全程穿著實驗服，并佩戴一次性無菌實驗手套。F.2.8試驗過程中，移液槍不應接觸任何盛放樣品或試劑的容器內(nèi)壁。F.2.9同一耗材（例如1.5mL離心管、移液槍頭等）不應重復接觸來自不同樣品的試驗材料。F.2.10試驗過程中，應小心開關容器蓋，樣品不宜長時間敞口放置。F.2.11懷疑或確定產(chǎn)生交叉污染的樣品、試劑或耗材，不應繼續(xù)使用。F.3環(huán)境DNA提取F.3.1試驗操作前，應用1.5%的漂白劑擦拭桌面。F.3.2DNA提取應全程佩戴口罩，防止刺激性氣味和交叉污染。F.3.3沉積物稱量和轉(zhuǎn)移宜選用一次性無菌稱量匙。F.3.4同一批次試驗應最后處理陽性對照樣品。F.3.5準確記錄陰性對照、陽性對照和試驗樣品的DNA濃度和質(zhì)量。F.3.6應按照要求對DNA樣品進行分裝和保存。環(huán)境DNA應長期保存，記錄準確，標記完整。F.3.7陰性對照、陽性對照和樣品的DNA應分開保存，在物理空間上相互獨立?？杀４嬖诓煌?，若條件有限，可保存在冰箱的不同分層。F.4宏條形碼擴增與保存F.4.1PCR反應宜在紫外線超凈工作臺中進行。F.4.2紫外線超凈工作臺使用前，應紫外線消毒30min。F.4.3原始測序數(shù)據(jù)應按照GB/T35890的規(guī)定保存為FASTQ文件，并準確記錄測序數(shù)據(jù)的樣品來源、編號、擴增引物和對應的標簽信息等。F.5生物信息學分析F.5.1陰性對照中的序列數(shù)應小于樣品平均序列數(shù)的10%，并剔除樣品中包含的陰性對照序列。F.5.2生物信息分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)應妥善存儲，并按照要求記錄保存位置。F.6數(shù)據(jù)記錄詳細準確記錄樣品信息、操作人、試驗數(shù)據(jù)及關鍵技術參數(shù)。實驗室主管應檢查所有數(shù)據(jù)記錄的正確性和完整性。數(shù)據(jù)