DB32T 3372-2018 東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20B05備案號(hào)：58108-2018DB32TechnicalTechnicalregulationofvirus-freefororientallily江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局IDB32/T3372—2018前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14脫毒設(shè)備（施）及化學(xué)試劑 15組培室消毒滅菌 16種源獲取 17病毒檢測(cè) 3DB32/T3372—2018本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙統(tǒng)利、孫明偉、邵小斌、朱朋波、湯雪燕、王江英。1DB32/T3372—2018東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了東方百合脫毒技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、脫毒設(shè)備、組培室消毒滅菌、種源獲取、病毒檢測(cè)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于具備生物技術(shù)條件下的東方百合脫毒技術(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T18247主要花卉產(chǎn)品等級(jí)第6部分：花卉種球NY/T1491花卉植物病毒檢測(cè)規(guī)程N(yùn)Y/T2306花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1東方百合orientallily由天香百合、鹿子百合、日本百合、紅花百合等種與湖北百合的雜種中選育出來(lái)的栽培雜種系。4脫毒設(shè)備4.1組培場(chǎng)地建設(shè)組培實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇安靜、清潔、無(wú)污染的地方。4.2洗滌設(shè)備工廠化生產(chǎn)可選用自動(dòng)洗瓶機(jī)，另外配置干燥箱、晾瓶架等。4.3百合脫除病毒設(shè)備超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、解剖刀、鑷子、解剖針、解剖鏡等。4.4滅菌設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、器械消毒器、紫外燈、烘干箱、微濾孔器等。2DB32/T3372—20185組培室消毒滅菌按NY/T2306要求進(jìn)行組培室消毒。6種源獲取6.1鱗片誘導(dǎo)成鱗莖6.1.1鱗片選取選取完整、無(wú)病蟲害無(wú)病斑且周徑≥14cm的百合鱗莖，由外向內(nèi)完整的剝?nèi)≈袑喻[片，流水沖洗凈表面泥垢后,用0.2%～0.5%的洗衣粉水沖洗10min，在自來(lái)水流水條件下沖洗30min。6.1.2外植體獲取用75%酒精滅菌30s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8min～10min，期間不斷進(jìn)行搖動(dòng)，使鱗片充分與溶液混合，最后用無(wú)菌水沖洗5次～6次。將鱗片外圍1mm的部分切除，然后選取外層下部與鱗莖盤相連的部分為最佳外植體橫切約為0.5cm厚的小塊。6.1.3誘導(dǎo)與增殖愈傷組織6.1.3.1愈傷培養(yǎng)基配方MS+2mg/L6-BA+1mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8～6.0。6.1.3.2鱗片接種將切好的百合鱗片，將底部切口平放于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，形成愈傷。6.1.4愈傷誘導(dǎo)成小鱗莖6.1.4.1培養(yǎng)基配方MS+0.5mg/L6-BA+15g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8～6.0。6.1.4.2愈傷接種將鱗片上的愈傷取出并切成黃豆粒大小，平放于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。6.1.4.3培養(yǎng)條件愈傷及成鱗莖誘導(dǎo)均放置于培養(yǎng)室中，置于23℃~27℃,進(jìn)行光照與黑暗比例為16h/8h條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3000lx～5000lx。在培養(yǎng)期間，每隔20d更換一次培養(yǎng)基。6.2組培鱗莖增大培養(yǎng)6.2.1組培鱗莖增大培養(yǎng)基配方MS+1mg/LIBA+60g/L蔗糖+6.5g/L，pH為5.8～6.06.2.2小鱗莖接種將分化的小鱗莖接種到組培鱗莖增大培養(yǎng)基上培養(yǎng)。3DB32/T3372—20186.2.3培養(yǎng)條件將接種的鱗莖，置于23℃~27℃條件下，暗培養(yǎng)60d即可長(zhǎng)成直徑大于0.5cm以上的組培鱗莖。在培養(yǎng)期間，每隔20d更換一次培養(yǎng)基。6.3打破休眠把增大的組培鱗莖，整瓶轉(zhuǎn)至4℃暗培養(yǎng)的冷藏室內(nèi)，暗培養(yǎng)60d～80d解除休眠。6.4熱處理將解除休眠的百合鱗莖，整瓶置于人工氣候箱中每天升高1℃至變溫培養(yǎng)（38℃-10h，26℃-14h）,暗培養(yǎng)持續(xù)15d～25d。6.5剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)成鱗莖6.5.1莖尖誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基MS+2.5mg/LPicloram+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8～6.06.5.2莖尖接種把熱處理過的百合組培鱗莖，在10倍～80倍的解剖鏡下，用解剖刀剝除外部鱗片漏出生長(zhǎng)點(diǎn)，用解剖針挑取0.5mm～0.7mm大小的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。6.5.3培養(yǎng)條件將接種的莖尖至于25℃條件下，全暗培養(yǎng)60d～80d，每20d更換一次培養(yǎng)基。6.6愈傷誘導(dǎo)成球按6.1.4與6.2的步驟進(jìn)行百合籽球的培養(yǎng)。7病毒檢測(cè)將脫毒的百合組培鱗莖，采用多重RT-PCR法（引物序列見表1）進(jìn)行主要病毒（黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、百合無(wú)癥病毒（Lilysymptomlessvirus，LSV）和百合斑駁病毒（Lilymosettlevirus，LMoV）的檢測(cè)，檢測(cè)