第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法-1課件

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1本章內(nèi)容提要

第一節(jié)顯微技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1

第一節(jié)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1—、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡1.構(gòu)成：?①照明系統(tǒng)?②光學(xué)放大系統(tǒng)?③機械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_13、最高分辨率：0.2um，由光的波動性質(zhì)決定（最小波390nm）R=0.61λN．sinα/24、三個條件：1必須用聚光透鏡將一束亮光聚焦到樣品上2需制備樣品，使之透光3設(shè)置一套合適的透鏡組第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（二）熒光顯微鏡?

特點：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡?

有兩個特殊的濾光片?

照明方式通常為落射式第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（三）激光共聚焦掃描顯微境（LCSM）?

用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描?

能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。?

分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。?

用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1

原理以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50－120KV)的平方根成反比?

由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成?

分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。?

用于觀察超微結(jié)構(gòu)，即小于0.2μm、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1

不同光線的波長

名稱可見光紫外光X射線α射線

電子束0.1Kv10Kv波長（nm）390~76013~3900.05~130.005~10.1230.0122第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_12、制樣技術(shù)?1）超薄切片?

電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機制作?

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_12）負(fù)染技術(shù)?

用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedActin第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_13）冰凍蝕刻?

亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中（－196℃）然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。AYeastCell第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（二）掃描電子顯微鏡第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。掃描電鏡主要用來觀察樣品表面的形貌特征，為避免干燥過程中樣品因表面張力的作用發(fā)生變形，常采用二氧化碳臨界點干燥法。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（三）掃描隧道顯微鏡（STM）?

原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV－2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。?

分辨率：橫向為0.1－0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。?

用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1掃描隧道顯微鏡原理第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1思考：比較電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的優(yōu)點及缺點。對下列目標(biāo)你用什么方法做最佳觀察：一個活的皮膚細(xì)胞、一個酵母線粒體、一個細(xì)菌、一條微管能否用透射式電子顯微鏡反映樣品的表面立體形貌，而用掃描式電鏡反映樣品內(nèi)部的狀況。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1三、顯微操作技術(shù)?

在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。?

顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。–

細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對非洲爪蟾進(jìn)行核移植獲得成功。我國著名學(xué)者童第周等上個世紀(jì)70年代在魚類細(xì)胞核移植方面進(jìn)行了許多工作，并取得了豐碩成果。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1顯微操作儀第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1

第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、離心技術(shù)?

是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段?

轉(zhuǎn)速為10－25kr/min的離心機稱為高速離心機?

轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機?

目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100kr/min，離心力超過500Kg。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（一）差速離心?

特點：–

介質(zhì)密度均一；–

速度由低向高，逐級離心。?

用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。?

沉降順序：核—線粒體—溶酶體與過氧化物酶體—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體—核蛋白體。?

可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（二）密度梯度離心?

用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。?

類型：速度沉降、等密度沉降。?

常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。?

分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：–1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；–2）PH中性或易調(diào)為中性；–3）濃度大時滲透壓不大；–4）對細(xì)胞無毒。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1四、免疫細(xì)胞化學(xué)?根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。?

免疫熒光法：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。?

酶標(biāo)免疫法：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1五、放射自顯影術(shù)?

用于研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。?

原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。?

一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3HUDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。–14C半衰期為5730年，3H為12.5年。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1

二、流式細(xì)胞術(shù)?

用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。?

原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1

三、細(xì)胞電泳?

原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。?

各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同。?

用途：檢測細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞，如分離哺乳動物的XY精子。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)?

群體培養(yǎng)：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層?

克隆培養(yǎng)：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長，每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。–

轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法：為制取細(xì)胞產(chǎn)品而設(shè)計，大容量旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使培養(yǎng)的細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)之中。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1原代培養(yǎng)：即：培養(yǎng)直接來自動物機體的細(xì)胞群，將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)?

細(xì)胞株：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。?

細(xì)胞系：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無限繁殖。?

克?。阂喾Q無性系。指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)1.外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。3.原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點：–①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；–②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；–③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。4.單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1PlantCellCultureAnimalCellCulture第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法_1二、細(xì)胞融合?

通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交。?

同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。?

異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。?

自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。?

誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合