《微生物發(fā)酵技術(shù)》-項(xiàng)目四 發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌操作

發(fā)酵工業(yè)常用滅菌方法項(xiàng)目四發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌操作課程導(dǎo)入加熱滅菌法輻射滅菌法過(guò)濾除菌法化學(xué)藥品滅菌法一、加熱滅菌法微生物細(xì)胞有蛋白質(zhì)組成，加熱使蛋白變性，從而達(dá)到消除微生物的作用。加熱滅菌法干熱滅菌法濕熱滅菌法火焰滅菌法干熱滅菌煮沸滅菌法巴氏消毒法間歇滅菌法高壓蒸汽滅菌法一、加熱滅菌法（一）干熱滅菌法原理:應(yīng)用：可使細(xì)胞膜破壞，蛋白質(zhì)變性和原生質(zhì)干燥，并可使各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化變質(zhì)。a.干熱滅菌器（160～170℃，1～1.5h）。b.火焰滅菌（接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌）。一、加熱滅菌法（二）濕熱滅菌法煮沸滅菌法將要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，一般微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都可以殺死，但不能殺死芽孢。巴氏消毒法較低溫消毒法，加熱到70℃左右，維持30分鐘，以殺死不耐高溫的物質(zhì)中的微生物和病原體的消毒法。牛奶、啤酒、黃酒、醬油和醋等用此法消毒。一、加熱滅菌法間歇滅菌法反復(fù)幾次的常壓蒸汽滅菌，以達(dá)到殺死微生物營(yíng)養(yǎng)體和芽孢的目的。操作步驟：100℃，15-30min；37℃恒溫過(guò)夜；三天。適用于不宜高壓滅菌的物質(zhì)，如糖類明膠牛奶培養(yǎng)基。（二）濕熱滅菌法一、加熱滅菌法高壓蒸汽滅菌適用于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)和發(fā)酵工廠中對(duì)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及附屬設(shè)備和管道的滅菌及多種器材的滅菌。實(shí)驗(yàn)室常用的是0.1MPa，121℃，15～30min。（二）濕熱滅菌法一、加熱滅菌法濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低。穿透力強(qiáng)，滅菌效果好。潛熱大，冷凝后水分利于濕熱滅菌。濕熱滅菌的缺點(diǎn)設(shè)備費(fèi)用高。適用范圍有限，不能用于怕潮的物料滅菌。二、輻射滅菌法01利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來(lái)殺死微生物，通常采用紫外線、X射線等進(jìn)行滅菌。02僅適用于表面滅菌和無(wú)菌室、培養(yǎng)間等空間的滅菌，且距照射物不超過(guò)1.2m；對(duì)固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料的滅菌。三、過(guò)濾除菌法利用過(guò)濾方法阻留微生物，適用于血清、抗生素及糖液的除菌。工業(yè)上常用過(guò)濾法大量制備無(wú)菌空氣，供好氧微生物培養(yǎng)過(guò)程使用。四、化學(xué)藥品滅菌法某些化學(xué)藥品與微生物發(fā)生反應(yīng)（蛋白變性、酶失活、細(xì)胞通透性）而具有殺菌的作用。1化學(xué)藥劑適于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等，不適用于培養(yǎng)基。2化學(xué)藥品的滅菌使用方法，根據(jù)滅菌對(duì)象的不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏蒸等。3四、化學(xué)藥品滅菌法⑴高錳酸鉀⑵漂白粉高錳酸鉀溶液的滅菌作用是使蛋白質(zhì)、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25％的溶液，主要用于皮膚消毒。漂白粉的化學(xué)名稱是次氯酸鹽(次氯酸鈉，NaOCl)，它是強(qiáng)氧化劑，用于用具和車間環(huán)境的滅菌。四、化學(xué)藥品滅菌法⑶75％酒精溶液使細(xì)胞脫水，引起蛋白質(zhì)凝固變性。對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、病毒、霉菌孢子均有殺死作用，但對(duì)細(xì)菌的芽孢殺死作用較差。常用于皮膚和器具表面殺菌。表面活性劑類潔凈消毒劑。它在水溶液中以陽(yáng)離子形式與菌體表面結(jié)合，引起菌體外膜損傷和蛋白變性，一般用于器具和生產(chǎn)環(huán)境的消毒，不能與合成洗滌劑合用，不能接觸鋁制品。⑷新潔爾滅四、化學(xué)藥品滅菌法⑸甲醛⑹過(guò)氧乙酸強(qiáng)還原劑，它能與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，以2份37％甲醛溶液與1份KMnO4混合，或者將37％甲醛溶液直接加熱，用于無(wú)菌室和車間空間的滅菌，缺點(diǎn)是穿透力差。強(qiáng)氧化劑，它是廣譜、高效、速效的化學(xué)殺菌劑，對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢、真菌孢子和病毒都有殺滅作用。四、化學(xué)藥品滅菌法⑺戊二醛在酸性條件下，不具有殺死芽孢的能力，只有在堿性條件下，才具有殺死芽孢的能力，常用2％的溶液，常用于器具、儀器和工具等滅菌。毒性較大，易污染環(huán)境，且水溶性差，使應(yīng)用受到限制，而酚類衍生物的使用，擴(kuò)大了作為消毒劑的使用范圍。⑻酚類發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌項(xiàng)目四發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌操作一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素（1）培養(yǎng)基成分油脂、糖類、蛋白質(zhì)，傳熱的不良介質(zhì)，會(huì)增加微生物的耐熱性，滅菌困難。高濃度鹽類、色素，削弱微生物的耐熱性，較易滅菌。一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素濃度較高培養(yǎng)基，需要較高溫度和較長(zhǎng)時(shí)間滅菌。低濃度的NaCL溶液對(duì)微生物有保護(hù)作用，隨濃度增加保護(hù)作用減弱。水中，加熱到60-65℃便死亡。10%的糖液中70℃處理4-6min。30%的糖液中70℃需處理30min。例如：大腸桿菌NaCL溶液濃度8%-10%時(shí)，則減弱微生物的耐熱性。一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素（2）培養(yǎng)基的物理狀態(tài)培養(yǎng)基中固體顆粒小，滅菌容易，顆粒大，則滅菌困難。一般說(shuō)來(lái)，顆粒對(duì)培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時(shí)，影響滅菌。固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間長(zhǎng)，例如100℃時(shí)液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間為1h，而固體培養(yǎng)基需要2-3h。一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素（3）pH值（4）泡沫pH值6.0～8.0，微生物最耐熱；pH<6.0，氫離子易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促使其死亡。泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，熱難穿透過(guò)去殺滅微生物。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式(一）分批滅菌分批滅菌是指將配置好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐中，通入蒸汽加熱至滅菌溫度，維持一定時(shí)間，再冷卻到接種溫度的滅菌方式，也叫實(shí)罐滅菌。分批滅菌是中小型發(fā)酵罐常用的一種滅菌方式。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式操作要點(diǎn)1.升溫階段滅菌前，排放夾套及蛇管中的冷水，開啟排汽管閥門，夾套內(nèi)通入蒸汽，發(fā)酵溫度上升到70℃時(shí)，開始由空氣過(guò)濾器、取樣管和放料管通入蒸汽，發(fā)酵罐內(nèi)溫度達(dá)到120℃時(shí)，壓力達(dá)到0.1MPa,開始保溫。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式2.保溫階段凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面以上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力，溫度恒定直到保溫結(jié)束。3.降溫階段保溫結(jié)束，關(guān)閉各排汽閥、進(jìn)汽閥，并通過(guò)空氣過(guò)濾器迅速向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣，維持發(fā)酵罐降溫過(guò)程中的正壓，且在夾套或蛇管中通入冷卻水，使培養(yǎng)基的溫度降到所需溫度。優(yōu)點(diǎn)不需要附屬設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，常用的滅菌方法。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)隨時(shí)間降低，罐利用率低；不能采用高溫快速滅菌工藝。缺點(diǎn)二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式（二）連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌指將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌的方法，也連消。分三種形式：連消塔加熱的連續(xù)滅菌。噴射加熱器加熱的連續(xù)滅菌。薄板換熱器加熱的連續(xù)滅菌。

二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式優(yōu)點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)成分破壞少；發(fā)酵罐非生產(chǎn)占用時(shí)間短，溶積利用率提高；蒸汽負(fù)荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便；適用于自動(dòng)化控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。缺點(diǎn)不適用于黏度大或固形物含量高的培養(yǎng)基的滅菌；增加了一套連續(xù)滅菌設(shè)備，增加了操作環(huán)節(jié)，增加了染菌的概率。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式1.連消塔加熱的連續(xù)滅菌蒸汽通入培養(yǎng)基中，快速加熱至殺菌溫度，維持一段時(shí)間，后冷卻至發(fā)酵溫度的過(guò)程。由連消塔、維持罐和冷卻器組成。配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70℃，防止培養(yǎng)基在殺菌時(shí)料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式連消塔使培養(yǎng)基迅速(20s)升溫(126-132℃)。維持罐使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時(shí)間。2-7min。冷卻管將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50℃，輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式4-4-1連消塔加熱的連續(xù)滅菌流程二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式2.噴射加熱器加熱的連續(xù)滅菌由噴射加熱、維持罐和真空冷卻器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)。蒸汽直接噴入待滅菌的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液急劇升溫到預(yù)定的滅菌溫度，培養(yǎng)基在該溫度送入維持管維持一段時(shí)間后，通過(guò)一膨脹閥進(jìn)入真空冷卻器冷卻，急速冷卻。該流程由于受熱時(shí)間短，故溫度可升到140而不引起培養(yǎng)基的嚴(yán)重破壞。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式A.連續(xù)直接蒸汽噴射型二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式01保證培養(yǎng)基先進(jìn)先出，避免過(guò)熱或者滅菌不徹底。02隨著蒸汽的冷凝使培養(yǎng)基稀釋。注意二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式3.薄板換熱器加熱的連續(xù)滅菌流程該流程采用了薄板換熱器作為培養(yǎng)基的加熱器和冷卻器，蒸汽在薄板換熱器的加熱段使培養(yǎng)基的溫度升高，經(jīng)維持階段保持一段時(shí)間，然后在薄板換熱器的冷卻段內(nèi)冷卻，從而使培養(yǎng)基的預(yù)熱、滅菌及冷卻過(guò)程可在同一設(shè)備內(nèi)完成。二、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌方式該流程雖然加熱和冷卻所需時(shí)間比使用噴射式連續(xù)滅菌時(shí)間長(zhǎng)，但滅菌周期比間歇滅菌小得多；由于