3-4基因工程制藥

泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷二、外源基因在大腸桿菌中的表達泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷（六）基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷Fn:質(zhì)粒保持率表示分批培養(yǎng)中細胞分裂n次后，培養(yǎng)液中基因工程細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值；α:質(zhì)粒丟失菌株與質(zhì)粒保持率菌株μ的比值。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列表現(xiàn)形式:結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性:重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性:整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）宿主細胞突變泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷1.缺失突變引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定性:現(xiàn)已觀察到在許多質(zhì)粒DNA中存在著自發(fā)缺失的現(xiàn)象；人工構(gòu)建的具有多個串聯(lián)啟動子的質(zhì)粒載體特別容易發(fā)生缺失作用。*2.重組作用引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定性:①一方面存在質(zhì)粒載體位點之間的同源重組；②另一方面大腸桿菌寄主染色體與質(zhì)粒載體上的IS因子或轉(zhuǎn)位因子，同樣也會引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。這是由于通過IS序列和轉(zhuǎn)位因子的插入作用、鄰位缺失或DNA倒位，都有可能使質(zhì)粒載體產(chǎn)生自發(fā)突變。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷由質(zhì)粒不平均的缺陷性分配(defectivepartitioning)所造成的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象,叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝:能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng):關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配:這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組質(zhì)粒的逃逸率當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸的原因有:高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒:重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)粒減少拷貝數(shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括:將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達型載體中，其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細胞的致死性基因安裝在載體上，同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜,成本較高泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略兩階段培養(yǎng)法:第一階段使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長?？刂颇康幕虻倪^量表達:可控型啟動子、可控型復(fù)制子優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成:限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度:較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定固定化泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷

（七）利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成NC肽（31）NCSSSSCN高爾基體內(nèi)的特異性肽酶SSSSCSSA肽（21）RRKRN信號肽B肽C肽A肽信號肽酶SS泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法:直接提取法制人胰島素早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。人胰島素的生產(chǎn)方法泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷化學(xué)合成法制人胰島素根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列,由單個氨基酸從頭合成。這條化學(xué)全合成的路線從技術(shù)上來說是能夠做到的,但其生產(chǎn)成本奇高,從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用。人胰島素的生產(chǎn)方法泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個氨基酸的差異，豬的為Ala，人的為Thr，因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素不失為一種選擇。上述思路的技術(shù)路線是:在pH為6-7的有機相中使胰蛋白酶催化其逆反應(yīng)，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團，最終獲得人胰島素。該過程的總轉(zhuǎn)化率為60%，但工藝路線耗時，分離純化操作復(fù)雜，產(chǎn)品的價格不菲。人胰島素的生產(chǎn)方法泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷基因工程法制人胰島素1982年,美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學(xué)等指標上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別,而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點,充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。人胰島素的生產(chǎn)方法泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達法基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列tacb-GalBpeptideoriAprMetMetMMNCMNtacb-GalApeptideoriAprMetMetMC泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達法表達產(chǎn)物的后處理路線:MMNCb-GalAMMNCb-GalBCNBr

處理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys

體外氧化和重折疊分離純化泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達法生產(chǎn)技術(shù)的評價:由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達180美元以上。為了進一步降低生產(chǎn)成本，美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達法基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略:tacb-GaloriAprMetMetBpeptideApeptide人胰島素原的cDNAMMNC重組人胰島素原轉(zhuǎn)化分離純化泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷SSSSSSNCR胰蛋白酶CNBrCNCpeptideMRRKRRKSSSSCNSS羧肽酶B重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達法表達產(chǎn)物的后處理路線:B鏈中第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折疊的原因，對胰蛋白酶不敏感羧肽酶B胰蛋白酶泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達法生產(chǎn)技術(shù)的評價:在人胰島素原表達工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高，折疊率高達80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目前美國ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈同時表達法tacb-GaloriAprMetMetMMNCApeptide化學(xué)合成AB鏈編碼序列重組人胰島素分離純化CNBr

處理特異性裂解體外折疊泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建分泌型重組人胰島素表達法上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達率高、穩(wěn)定性強,但不能分泌,只能以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與β-內(nèi)酰胺酶基因拼接,β-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時具備了穩(wěn)定高效表達可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性,為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負擔(dān)。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷作業(yè)一、簡答1、宿主細胞的選擇原則有哪些？2、簡述表達載體必需具備的條件。3、簡述大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的優(yōu)缺點。4、簡述各種表達系統(tǒng)的類型和特點。5、最佳啟動子應(yīng)具備哪些條件？6.選用強終止子的必要性有哪些？7、核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響有哪些？8、如何根據(jù)密碼子偏愛性使外源基因在大腸桿菌細胞中高效表達？9、大腸桿菌異源蛋白的表達類型及特點有哪些？10、簡述基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制。11、改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略有哪些？12、基因工程法制人胰島素的技術(shù)路線有那幾條？二、名詞包涵體、宏觀逃逸率、補料分批培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、高密度培養(yǎng)泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷第八節(jié)基因工程菌的培養(yǎng)工程菌的培養(yǎng)過程：搖瓶操作（溫度、pH、培養(yǎng)基組分、碳氮比）；培養(yǎng)罐操作（確定培養(yǎng)參數(shù)、控制方案、順序）一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1.補料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法。通常把溶氧控制與流加補料結(jié)合起來進行。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2、連續(xù)培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開動進料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率進行不間斷的培養(yǎng)。3、透析培養(yǎng)：利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去處培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。4.固定化培養(yǎng)：將固定化技術(shù)用于工程菌的培養(yǎng)，質(zhì)粒穩(wěn)定性大大提高，特別是對分泌型菌種。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷菌種一級種子搖瓶二級種子罐培養(yǎng)擴大培養(yǎng)

原料發(fā)酵培養(yǎng)基配制滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離

微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷1.培養(yǎng)基的影響使用不同的碳源對菌體的生長和外源基因的表達有較大的影響。如以甘油為碳源，菌體得率較大，而以葡萄糖為碳源菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多。葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用,采用流加措施,控制培養(yǎng)液中葡萄糖的較低濃度,可減弱或消除葡萄糖的阻遏作用。還有無機磷對產(chǎn)物的影響也較大。碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。其他：無機鹽、微量元素維生素、生物素等。二、基因工程菌的發(fā)酵工藝泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2、接種量的影響接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。它的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，延長菌體延遲期，不利于外源基因的表達，采用大接種量，由于種子液中含有大量水解酶，有利于對基質(zhì)的利用，但接種量過大往往會使菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。3.溫度的影響溫度對基因表達的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子的合成水平上。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷溶解氧是發(fā)酵培養(yǎng)中影響菌體代謝的一個重要參數(shù),對菌體的生長和產(chǎn)物的生成影響很大。維持較高水平的DO2值（>40%）有利于重組質(zhì)粒細胞的生長及外源蛋白產(chǎn)物的形成。在誘導(dǎo)表達期間,要維持外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯,細胞需要大量的能量代謝以促進呼吸作用。因此通過增大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速以保證較大的溶氧值,不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。4.溶解氧的影響泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷5.誘導(dǎo)時間對外源蛋白表達的影響誘導(dǎo)時間:加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時間。隨著誘導(dǎo)時間的延長，外源蛋白的表達量增加，但外源蛋白在細胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。誘導(dǎo)時間對酶表達水平和活力的影響誘導(dǎo)時間酶活力酶表達水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷6.誘導(dǎo)時機對表達的影響誘導(dǎo)時機指加入誘導(dǎo)劑的時間以天冬酰氨酶表達為例,見表。A600=0.295*10時生長速度比較快,這時菌體進入誘導(dǎo)狀態(tài),酶蛋白的積累加快,酶活和表達水平都較高。而菌體進入對數(shù)期后期,由于發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗,及代謝產(chǎn)物的積累,使菌體的生長速度受到抑制。在此狀態(tài)下誘導(dǎo),表達顯然受到影響。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷誘導(dǎo)時機對酶表達水平和活力的影響生物量（A600）

酶活力酶表達水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶0.0340.1110.0650.070.0650.050.04泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷7、pH值對工程菌生長和表達的影響在相同通氣量和攪拌速度下,pH值對不同菌群生長影響不大,而對外源蛋白表達有一定影響。由于工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)工藝,前期為菌體生長階段,后期為蛋白誘導(dǎo)表達階段。細胞生長期的最佳pH范圍在6.8-7.4,外源蛋白表達的最佳pH為6.0-6.5。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備發(fā)酵罐作為基因重組體的培養(yǎng)裝置,與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別,即不僅要防止外部微生物侵入罐內(nèi),還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。按實驗準則,可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量20L以上和20L以下兩種。應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。它不同于微生物發(fā)酵,微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級或次級代謝產(chǎn)物,細胞生長并非主要目標,而基因工程發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷發(fā)酵罐的組成有:發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無菌過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制和連續(xù)操作系統(tǒng)對發(fā)酵罐要求:提供菌體生長最適生長條件；培養(yǎng)過程不得污染；保證純菌培養(yǎng)；培養(yǎng)及消毒過程不得游離異物，不能干擾細菌代謝活動等。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷第九節(jié)高密度發(fā)酵HCDC（high-celldensitycultivation）HCDC的定義、優(yōu)勢HCDC的主要限制因素及解決方法HCDC的生物反應(yīng)器HCDC的補料策略泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷1.1高密度培養(yǎng)的定義高密度培養(yǎng):是應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和設(shè)備來提高菌體生物量和目標產(chǎn)物時空產(chǎn)率的發(fā)酵技術(shù)。一般認為，細胞密度接近理論值的培養(yǎng)為高密度培養(yǎng)。但由于菌種、菌株及目標產(chǎn)物差異性較大，高密度培養(yǎng)的最終菌體生物量無法用一個確切的值或范圍界定。理論上大腸桿菌發(fā)酵所能達到的最高菌體密度為400g/L，考慮到實際情況的種種條件限制，目前最高菌體密度為200g/L，此時，發(fā)酵液25%充滿長3μm，寬1μm的菌體，發(fā)酵液粘度很高，幾乎散失流動性。而某些極端微生物細胞密度達到數(shù)克每升也可認為是高密度培養(yǎng)。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷高密度培養(yǎng)技術(shù)最早用于酵母細胞的培養(yǎng)提高生物量或生產(chǎn)單細胞蛋白及乙醇的生產(chǎn)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,構(gòu)建基因工程菌已經(jīng)成為提高目標蛋白表達水平的一項基本手段?；蚬こ叹^量表達目標產(chǎn)物還有助于簡化后續(xù)的分離純化操作,同時也便于基因工程改造。其中大腸桿菌、酵母是最常用的重組表達宿主菌泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷1.2高密度培養(yǎng)的優(yōu)勢提高最終菌體生物量和目標產(chǎn)物的時空產(chǎn)率縮小生物反應(yīng)器體積,降低設(shè)備投資縮短發(fā)酵周期,減少水電使用,降低生產(chǎn)成本便于下游分離純化工藝等。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2.HCDC的主要限制因素固態(tài)或揮發(fā)性底物在液態(tài)培養(yǎng)基中溶解限制底物對細胞生長可能存在限制或抑制作用底物和產(chǎn)物的穩(wěn)定性差或易揮發(fā)產(chǎn)物降解產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對細胞生長產(chǎn)生限制呼吸作用導(dǎo)致C02和熱量的急劇積聚氧氣需求量大培養(yǎng)基黏度增加副產(chǎn)物的積累與毒害作用泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2.1培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)要求培養(yǎng)基含有細胞生長所需的所有營養(yǎng)成分,配比均衡,且濃度不會對細胞生長產(chǎn)生抑制作用。一般采用營養(yǎng)成分清晰的全合成培養(yǎng)基,便于發(fā)酵過程的調(diào)節(jié)控制和進一步的擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)基必須包含細胞生長必需的碳源、氮源、無機鹽及生長因子。高密度培養(yǎng)的初始發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分必須低于抑制濃度,并結(jié)合恰當(dāng)?shù)牧骷友a料策略提供營養(yǎng)物質(zhì),使細胞生長維持在最佳狀態(tài)。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2.2培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度隨菌種、培養(yǎng)基成分和細胞生長階段的不同而不同,溫度不僅影響發(fā)酵液的理化性質(zhì),還對外源蛋白的表達和活性有很大的影響。細胞密度較高時,呼吸作用釋放大量熱量導(dǎo)致發(fā)酵液的溫度升高,因此發(fā)酵設(shè)備需要快速有效的降溫散熱系統(tǒng)。溫度還可作為高密度發(fā)酵的調(diào)控手段泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷溫度的調(diào)控目前主要的控溫策略是手動調(diào)節(jié)冷卻水的流量針對不同的發(fā)酵過程，罐溫控制方式也不相同。大致分為兩類（據(jù)發(fā)酵過程中最適溫度是否變化）:定值控制程序設(shè)定控制（例如:自適應(yīng)PID等）泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2.3pH發(fā)酵體系pH值是發(fā)酵液成分與細胞代謝綜合作用的結(jié)果。C源消耗而產(chǎn)生的有機酸,CO2的溶解,補料的流加,次級代謝產(chǎn)物的積累,菌體自溶裂解等都可導(dǎo)致pH的變化。pH不僅是反映細胞生長代謝的指標,也是調(diào)控高密度培養(yǎng)的手段泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷pH調(diào)節(jié)pH的調(diào)節(jié)需要從發(fā)酵初始培養(yǎng)基開始，初始pH不同，最終發(fā)酵效果可能也會有很大差異。發(fā)酵過程中pH的調(diào)節(jié)，可分為兩種：內(nèi)源性調(diào)節(jié)：過程中通過補加C.N源調(diào)節(jié)（C源經(jīng)代謝產(chǎn)酸使pH降低；供能不足時，N源的C骨架作為能源參與代謝，產(chǎn)生NH+4,使pH升高）外源性調(diào)節(jié)：流加酸（H3PO4）堿（氨水）調(diào)節(jié)。氨水還可以作為N源。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2.4溶解氧（DO）溶解氧(DO)濃度很大程度上影響細胞生長及外源蛋白的表達。DO濃度隨菌體密度的增加和呼吸作用的增強而降低,發(fā)酵液黏度增加也會影響氧傳遞的速率。DO濃度一旦低于臨界氧濃度值,細胞停止生長,甚至死亡。泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷溶解氧的調(diào)節(jié)物理方法調(diào)節(jié):增加空氣流量，提高攪拌轉(zhuǎn)速；增大罐壓；通入純氧（混合不均，易養(yǎng)中毒）化學(xué)方法調(diào)節(jié):加入H2O2（利用菌體產(chǎn)生的過氧化氫酶促使其分解產(chǎn)生O2）生物改造方法:在菌體中克隆具有提高養(yǎng)傳遞能力的透明顫藻蛋白（VHB）泰山學(xué)院生物工程與釀酒學(xué)院生物技術(shù)制藥朱紅艷2.5比生長速度比生長速率（μ=（dN/dT）/N）是高密度培養(yǎng)過程中最重要的過程參數(shù),它影響細胞對營養(yǎng)成分的吸收和分配、細胞的生長、外源蛋白的表達與折疊、核糖體的濃度、RNA的濃度和副產(chǎn)物的生成與積累等一般認為大腸桿菌的比生長速率控制在0.1-0.3h-1之間較合適,能較好地避免或減少副產(chǎn)物乙酸的生成。但比生長速率也應(yīng)根據(jù)菌