生物學(xué)案：第四章第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)習(xí)目標(biāo)重點(diǎn)難點(diǎn)1.能記住PCR技術(shù)的概念。2．能說出PCR的大致過程。重點(diǎn)：會(huì)分析生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的區(qū)別。難點(diǎn)：能運(yùn)用PCR的原理解決日常生活中的實(shí)際問題。一、分子生物學(xué)進(jìn)展1．______________________的建立,奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。2．____________________具有重大作用和深遠(yuǎn)意義.3．原核生物、真核生物的細(xì)胞已被用于大批量生產(chǎn)________、________等外源蛋白。4．____________也可以作為天然的生物反應(yīng)器,用于生產(chǎn)新的或改造過的基因產(chǎn)物。5．我國自1986年提出________計(jì)劃至今，在生物技術(shù)方面已取得了一系列突破性進(jìn)展，許多成果已轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力.預(yù)習(xí)交流分子生物學(xué)近年來進(jìn)展神速，你了解其在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的現(xiàn)狀嗎？二、PCR技術(shù)1．概念：PCR又叫______________，是一種體外迅速____________或__________的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2．原理:遵循______________原則.3．條件:模板：__________；酶：____________；原料：__________的脫氧核苷酸;引物。4．過程：PCR一般要經(jīng)過________循環(huán)，每一次循環(huán)都可以分為______、______、______三步.5．結(jié)果：按____進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。預(yù)習(xí)交流1．DNA分子由兩條脫氧核苷酸鏈組成，和親代DNA分子相比，子代DNA的兩條鏈有何特點(diǎn)?2?；貞洸⒑?jiǎn)述DNA的復(fù)制過程。3．PCR的變性過程實(shí)質(zhì)上也是解旋，PCR的解旋和細(xì)胞內(nèi)的DNA解旋有何不同?4．PCR技術(shù)有何應(yīng)用？答案：一、1。DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型2．DNA重組技術(shù)和基因克隆3．胰島素干擾素4．植物與動(dòng)物“863"預(yù)習(xí)交流：提示：我國已成功培育出轉(zhuǎn)基因水稻、大豆、小麥、棉花、番茄、煙草等品種,其中的一些已經(jīng)被批準(zhǔn)進(jìn)行大田試種和種植，如抗蟲棉。二、1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特定基因DNA序列2．堿基互補(bǔ)配對(duì)3．兩條母鏈DNA聚合酶4種游離4．三十多次變性退火延伸5．2n預(yù)習(xí)交流:1．提示:構(gòu)成子代DNA的兩條鏈一條鏈?zhǔn)怯H代DNA的鏈（母鏈），一條鏈?zhǔn)切潞铣傻逆湥ㄐ律湥@種復(fù)制叫半保留復(fù)制。2．提示：DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解開的每一段母鏈為模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成與母鏈堿基互補(bǔ)的一段子鏈,隨著模板鏈解旋過程的進(jìn)行,新合成的子鏈也不斷延伸，同時(shí)，每條新鏈與其對(duì)應(yīng)的模板鏈盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu).3．提示：PCR在高溫條件下（90～100℃）解旋，而細(xì)胞內(nèi)的DNA在解旋酶的作用下解旋.4．提示:基因克隆、DNA序列測(cè)定、遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)。在預(yù)習(xí)中還有哪些問題需要你在聽課時(shí)加以關(guān)注？請(qǐng)?jiān)谙铝斜砀裰凶鰝€(gè)備忘吧！我的學(xué)困點(diǎn)我的學(xué)疑點(diǎn)一、PCR技術(shù)的原理及條件1．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制需要的基本條件有哪些?該條件在DNA復(fù)制中起何作用?2．DNA復(fù)制過程為什么需要引物？哪種物質(zhì)可以作為引物?3．討論：DNA合成的方向有什么特點(diǎn)？兩條子鏈的合成起始于DNA的同一端嗎？4．在DNA復(fù)制時(shí)，雙鏈的解開是進(jìn)行DNA復(fù)制的前提，在體外如何使雙螺旋結(jié)構(gòu)打開呢？5．由于PCR過程的溫度很高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活,人們是怎樣解決這一問題的呢？6．PCR擴(kuò)增需要哪些條件呢?1．美國科學(xué)家莫里斯發(fā)明的PCR技術(shù)，是一種DNA分子“復(fù)印機(jī)”,它可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)將一個(gè)DNA分子復(fù)制出1千億個(gè),解決了檢測(cè)樣本擴(kuò)增的難題。在人類基因組計(jì)劃實(shí)施中，PCR技術(shù)使每個(gè)核苷酸的識(shí)別成本降至5~10美元。莫里斯因發(fā)明PCR技術(shù)榮獲了諾貝爾獎(jiǎng)。(1)DNA分子在復(fù)制時(shí)需要大量的______________作原料，在DNA聚合酶的催化下利用解旋后的單鏈為________，進(jìn)行生物合成。（2）在DNA分子解旋時(shí)必須加熱，普通的酶容易________________，莫里斯從溫泉中找到了耐95℃高溫的__________，解決了酶重復(fù)使用的難題,使鏈?zhǔn)椒磻?yīng)成為可能.每次循環(huán)可以分為________、________、________三步。（3）高溫酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用說明了地球生物____________的重要，大自然的________庫是人類的寶貴財(cái)富。2．下圖是PCR體外擴(kuò)增DNA過程中哪次循環(huán)的產(chǎn)物？()A．第一次循環(huán)B．第二次循環(huán)C．第三次循環(huán)D．第四次循環(huán)1．PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較體內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)不同點(diǎn)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開加熱至94℃左右,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成,控制溫度72℃特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增TaqDNA聚合酶不需要需要循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次溫度體內(nèi)溫和條件高溫（可變）相同點(diǎn)①需提供DNA復(fù)制的模板②四種脫氧核苷酸為原料③都需要一定的緩沖溶液④子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端2．DNA母鏈的3′端對(duì)應(yīng)著子鏈的5′端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹?．解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開，而DNA聚合酶與DNA連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵的.4．DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板，而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板.二、PCR技術(shù)的過程1．PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為哪幾步？2．PCR循環(huán)之前，常要進(jìn)行一次預(yù)變性，預(yù)變性的目的是什么？3．PCR緩沖液相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)的什么成分？4．當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度由變性后緩慢冷卻到50℃左右時(shí),引物與模板可結(jié)合，而解開的兩個(gè)DNA模板鏈能夠重新結(jié)合嗎？為什么？5．PCR過程中的DNA聚合酶能對(duì)最初的DNA模板進(jìn)行完整的復(fù)制嗎?為什么？標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、退火、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是（）。A．94℃、55℃、72℃B．72℃、50℃、92℃C．50℃、92℃、72℃D．80℃、50℃、72℃1．PCR反應(yīng)過程圖解（1）變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈，如下圖：（2）退火：系統(tǒng)溫度下降至55℃時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖：（3）延伸:當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如下圖:2．PCR過程的溫度條件和時(shí)間控制變性退火延伸預(yù)變性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃,30s72℃，1min三、PCR實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果分析評(píng)價(jià)1．討論P(yáng)CR實(shí)驗(yàn)過程中有哪些注意事項(xiàng).2．如何判斷DNA擴(kuò)增成功?PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、緩沖溶液以及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是（）.A．反復(fù)洗滌B．用酒精擦洗C．高壓滅菌D．在－20℃下儲(chǔ)存1．DNA擴(kuò)增數(shù)目的理論計(jì)算理論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長。若只有一條DNA模板，則復(fù)制n次后有2n條；若一開始有m條DNA模板，則復(fù)制n次后有m×2n條；實(shí)際操作過程中由于無關(guān)變量的影響，一般來說實(shí)驗(yàn)值要略小于理論值。2．DNA含量的測(cè)定稀釋：2μLPCR反應(yīng)液,加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋↓對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零↓測(cè)定：取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值↓計(jì)算：DNA含量（μg/mL）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)答案：活動(dòng)與探究一：1．提示：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制需要的基本條件和作用分別是：（1）解旋酶：打開DNA雙鏈.（2）DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板.（3）4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料。（4）DNA聚合酶:催化合成DNA子鏈。(5）引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。2．提示：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物.RNA或小段單鏈DNA都可以作為引物。3．提示：（1）DNA的羥基末端稱為3′端,磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端,且DNA的一條鏈為3′→5′，另一條互補(bǔ)鏈為5′→3′，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪虻?（2）DNA合成的方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸（即沿母鏈的3′→5′)，所以兩條子鏈的合成分別起始于DNA的兩端。4．提示:PCR原理：利用DNA的熱變性原理。即在90～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開,這個(gè)過程稱為變性，當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA單鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。5．提示：發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用了耐高溫的TaqDNA聚合酶，大大增加了PCR的效率。6．提示：PCR反應(yīng)需要提供組分：DNA模板、分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶。同時(shí)，在一定的緩沖液中，通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。遷移與應(yīng)用：1．解析：DNA復(fù)制過程中需要的條件是:模板、原料（四種脫氧核苷酸）、酶、能量和引物，酶一般是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)不能耐受60～80℃的高溫,而DNA在80℃以上才會(huì)變性，解開雙鏈。為了解決DNA聚合酶失活問題，20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)了耐高溫的TaqDNA聚合酶。PCR的每次循環(huán)可分為變性、退火、延伸三步。答案：（1）脫氧核苷酸模板（2）變性（失活）TaqDNA聚合酶變性退火延伸（3）多樣性基因2．A解析：在PCR反應(yīng)中,以引物為起點(diǎn)，第一次循環(huán)時(shí)，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每個(gè)子DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng)，所以會(huì)形成DNA分子兩端均含引物的情況,如下圖所示：因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。活動(dòng)與探究二:1．提示:每次循環(huán)可以分為變性、退火和延伸三步。2．提示：預(yù)變性的目的是增加大分子模板DNA徹底變性的概率。3．提示：由于緩沖液為DNA的復(fù)制提供場(chǎng)所，相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的場(chǎng)所，所以緩沖液相當(dāng)于核基質(zhì)。4．提示：不能。（1）模板DNA鏈比引物長得多而且復(fù)雜得多，不易重新結(jié)合。（2）引物和模板之間的碰撞機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩個(gè)DNA模板鏈之間的碰撞機(jī)會(huì).（3)加入的引物的量足夠大，而模板數(shù)量少。5．提示：不能。由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸,這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。遷移與應(yīng)用：A解析：當(dāng)溫度上升到94℃時(shí)，作為模板的雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA，稱之為變性；當(dāng)溫度下降到40～60℃時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度回升到72℃左右（TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度)時(shí)，在單鏈上4種脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則連接在引物之后，使引物鏈延伸，形成互補(bǔ)的DNA雙鏈.活動(dòng)與探究三:1．提示：（1）避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。(2）緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存.（3）每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭.(4）混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。2．提示：（1)教材中的方法，可以通過計(jì)算DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。（2）電泳檢測(cè)的方法,可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。遷移與應(yīng)用:C解析:為了避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在－20℃下儲(chǔ)存。使用前，將所需的試劑從冰箱內(nèi)拿出,放在冰塊上緩慢融化。1．PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比,主要有兩點(diǎn)不同，它們是（).①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA②PCR過程不需要DNA聚合酶③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制A．③④B．①②C．①③D．②④2．DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是（）。A．可加快DNA的復(fù)制速度B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA鏈D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈3．PCR技術(shù)利用了DNA的熱變性原理，PCR儀實(shí)際上是一種能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。下列對(duì)PCR過程中“溫度的控制”的說法,錯(cuò)誤的是（).A．PCR反應(yīng)需要高溫，是為了確保模板是單鏈B．延伸的溫度必須大于退火溫度，而小于變性溫度C．要用耐高溫的DNA聚合酶D．需要耐高溫的解旋酶4．從第二次循環(huán)開始，復(fù)制的DNA片段呈______擴(kuò)增（）。A．直線B．