醫(yī)學(xué)超級(jí)全核醫(yī)學(xué)第六章

1第六章體外分析皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院陶紹能2定義體外分析以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標(biāo)記的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行的微量生物活性物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。3放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)在體外進(jìn)行機(jī)體內(nèi)物質(zhì)種類和含量的分析測(cè)定。測(cè)定對(duì)象是患者血清或其他體液樣品內(nèi)的激素、其它生物活性物質(zhì)和藥物濃度等。4體外放射分析技術(shù)是結(jié)合了放射性核素的高靈敏度和特異性結(jié)合反應(yīng)的高特異性的一種超微量分析技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好、樣品用量少、放射線不引入人體內(nèi)、應(yīng)用面廣、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。是對(duì)多種疾病診治和研究的重要方法之一。1959年由美國(guó)Berson&Yalow建立了本方法，Yalow為此在1977年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)5體外分析技術(shù)建立的基礎(chǔ):添加標(biāo)題以配體和結(jié)合體的特異性結(jié)合反應(yīng)為共同的生物學(xué)基礎(chǔ)01添加標(biāo)題以結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律作為共同的方法學(xué)基礎(chǔ)02添加標(biāo)題以放射性等的測(cè)量技術(shù)作為共同的定量手段036生物學(xué)基礎(chǔ)：特異性結(jié)合反應(yīng)配體-結(jié)合體抗原-抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)；配基-受體的結(jié)合反應(yīng)；底物-催化酶之間的酶促反應(yīng)；激素-激素結(jié)合球蛋白的結(jié)合反應(yīng)7方法學(xué)基礎(chǔ)：結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律遵守可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律：k1,v1+[R][RL]k2,v28定量手段

(標(biāo)記配體作為示蹤劑)放射性測(cè)量技術(shù)酶定量技術(shù)化學(xué)發(fā)光定量技術(shù)熒光定量技術(shù)9體外分析技術(shù)體外放射分析體外非放射分析放射性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析放射性非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析放射免疫分析

(radioimmunoassay,

RIA)免疫放射分析酶免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析熒光免疫分析(immunoradiometricassay,

IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)分類:10放射免疫分析

radioimmunoassay,RIA11Dr.Yalow放射免疫分析法是Yalow和Berson于1959年在研究胰島素的時(shí)候創(chuàng)立的一種體外放射分析技術(shù)。結(jié)合了放射性核素的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高特異性。12一、RIA的基本原理競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合反應(yīng)：放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標(biāo)記抗原（Ag）與定量的標(biāo)記抗原（*Ag）對(duì)限量的特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合反應(yīng)。Ag和*AgAb間呈負(fù)相關(guān)函數(shù)關(guān)系13基本原理

Ag-Ab+Ag*Ag

AbAg++*Ag-Ab+

*Ag(B)(F)*Ag與Ag

免疫活性相同*Ag＋Ag>

AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)14Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+++++++++++++++++++++Ag15（二）劑量反應(yīng)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)記物與被測(cè)物之間的函數(shù)關(guān)系可以用劑量反應(yīng)曲線來(lái)表示。劑量反應(yīng)曲線是用一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原反應(yīng)而繪制出來(lái)的，所以又叫標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)抗原(標(biāo)準(zhǔn)品)是廠家在試劑盒中提供的已知?jiǎng)┝康姆菢?biāo)記抗原。16標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原和一定量的標(biāo)記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)；在反應(yīng)達(dá)到平衡后，利用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離B和F；分別測(cè)量B和F的放射性；用反應(yīng)變量（如B/F）作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量作為橫坐標(biāo)（即一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作一條曲線，就得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)反應(yīng)變量的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，這就是劑量反應(yīng)曲線。17分離B、FR=B/F濃度B1%F%=F/(B+F)B6%B%=B/(B+F)B5%AgB2%AbB4%AgB3%18B%標(biāo)準(zhǔn)曲線#202219未知樣品的測(cè)量在同等條件下，用待測(cè)抗原與一定量的標(biāo)記抗原與限量特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，并用同樣的方法分離待測(cè)抗原的B和F，測(cè)量其放射性，計(jì)算出B/F，在劑量反應(yīng)曲線上就可以查出對(duì)應(yīng)的抗原濃度。20AgB1%AgB2%AbB3%分離B、FB4%單擊此處添加正文。B5%單擊此處添加正文。B6%單擊此處添加正文。B%2160B%CalibrationCurve01F%單擊此處添加正文。02B/F單擊此處添加正文。0322在實(shí)際的操作中，一般要設(shè)立：最大結(jié)合管（Bo）：標(biāo)準(zhǔn)抗原的量為0，只有標(biāo)記抗原和特異性抗體時(shí)，標(biāo)記抗原與抗體充分反應(yīng)后分離B和F，所測(cè)得的B的放射性為Bo。這是沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)抗原與之競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合達(dá)最大值。非特異結(jié)合管（NSB）：標(biāo)記抗原除了要和特異性抗體結(jié)合以外，還要和一些雜質(zhì)蛋白或容器的管壁等結(jié)合，對(duì)我們的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體，在相同條件下反應(yīng)后測(cè)得的放射性。23總放射性管（T）：反應(yīng)后不分離就直接測(cè)得的放射性就是總放射性。表示標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物和游離的標(biāo)記抗原的總放射性。標(biāo)準(zhǔn)管（B1~Bn）：放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，再加入相同量的標(biāo)記抗原和特異抗體。一般在反應(yīng)后分離出沉淀，測(cè)定沉淀的放射性作為B。樣品管（Bx）：用同劑量的樣品代替標(biāo)準(zhǔn)管中的標(biāo)準(zhǔn)抗原，在相同條件下反應(yīng)和分離，同樣取沉淀測(cè)得其放射性，就可以在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣品的濃度。24選用不同的反應(yīng)變量作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀也不同。常用的有B%，B/F，B/Bo，F(xiàn)/B，Bo/B等。25標(biāo)準(zhǔn)曲線左：橫座標(biāo)為等份刻度；右：橫座標(biāo)為對(duì)數(shù)刻度26二、RIA基本試劑（一）標(biāo)準(zhǔn)抗原是廠家給出已知?jiǎng)┝康姆菢?biāo)記抗原。一般每一個(gè)RIA試劑盒里都有濃度由小到大的多瓶標(biāo)準(zhǔn)抗原。27標(biāo)準(zhǔn)抗原的要求：標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測(cè)抗原、標(biāo)記抗原具有基本相同的免疫活性，即質(zhì)同。他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)要相同，對(duì)特異性抗體的親和力要相同。并且，標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測(cè)抗原所處的介質(zhì)條件要相同。28定量要準(zhǔn)確：整個(gè)RIA分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標(biāo)準(zhǔn)抗原的量，因此標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量一定要準(zhǔn)確，即與國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品相比有良好的可比性。只有保證標(biāo)準(zhǔn)抗原的準(zhǔn)確定量，才能保證RIA分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精確度。29必須高純度：標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)該含有盡可能少的化學(xué)雜質(zhì)，以避免雜質(zhì)對(duì)反應(yīng)和計(jì)量的影響。01穩(wěn)定性要好：要保證在試劑盒的運(yùn)輸、儲(chǔ)存和在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該不發(fā)生降解，分離、破壞等。02301）比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分?jǐn)?shù)。>90%2）半衰期足夠長(zhǎng)3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I（二）標(biāo)記抗原31標(biāo)記抗原的要求質(zhì)同，即標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原、待測(cè)抗原的化學(xué)性質(zhì)和免疫活性要相同。標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。比活度高則在允許的相同的測(cè)量統(tǒng)計(jì)誤差的前提下，所使用的標(biāo)記抗原的量必然減少，那么在反應(yīng)中與之競(jìng)爭(zhēng)的待測(cè)抗原的量也相應(yīng)減少，方法的靈敏度就提高了。但過(guò)高的比活度，也會(huì)引起諸如輻射自分解和免疫活性受損的問(wèn)題。323、標(biāo)記抗原要有足夠高的放射化學(xué)純度，一般要大于95%。放射化學(xué)純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對(duì)RIA的免疫反應(yīng)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響。由于存在放射性核素的衰變，因此在長(zhǎng)期儲(chǔ)存后的標(biāo)記抗原一般要經(jīng)過(guò)重新提純后才能再次使用。33標(biāo)記抗原的穩(wěn)定性要好：和標(biāo)準(zhǔn)抗原相比，標(biāo)記抗原由于有了放射性核素射線的影響，更容易發(fā)生分解。在標(biāo)記抗原的儲(chǔ)存上，應(yīng)遵循標(biāo)記化合物的保存原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。34（三）特異性抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體?？贵w的質(zhì)量之間關(guān)系到RIA分析方法的靈敏度和特異性。35抗體的要求（三高）P2P1高親和力高特異性P3高滴度36抗體的檢測(cè)指標(biāo)親和常數(shù)K（affinityconstant）：親和常數(shù)反應(yīng)了抗體與抗原的親和力。K值越大，形成抗體抗原復(fù)合物速度快，解離少，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精確度都好。K=結(jié)合常數(shù)k1/解離常數(shù)k2。37交叉反應(yīng)率：指抗體識(shí)別相應(yīng)抗原類似物的能力，反應(yīng)了抗體的特異性。在生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。交叉反應(yīng)率越低，則說(shuō)明抗體與抗原類似物的交叉反應(yīng)就越小，其識(shí)別抗原類似物的能力就越強(qiáng)，特異性就越強(qiáng)。38即將被測(cè)物質(zhì)和其類似物，分別作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，比較兩者在其結(jié)合率為零管（B/B0）的50%時(shí)的劑量響應(yīng)濃度，其比值即為交叉反應(yīng)百分率，也就是該抗體對(duì)被測(cè)物某種類似物的相應(yīng)活力。常用50%置換法來(lái)測(cè)定交叉反應(yīng)的百分率。39滴度：又稱稀釋度，反映了抗血清中有效抗體的濃度。指在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)抗原存在的時(shí)候，結(jié)合50%的標(biāo)記抗原時(shí)抗血清的稀釋度。其方法就是用緩沖液將抗血清稀釋為不同的濃度，各置于試管中，然后各加一定量的標(biāo)記抗原進(jìn)行反應(yīng)，等到反應(yīng)平衡后分離B和F，測(cè)出B的放射性，算出B%，以B%為縱坐標(biāo)以抗血清的稀釋度為橫坐標(biāo)作出抗血清稀釋曲線，B%為50%所對(duì)應(yīng)的抗血清滴度為工作滴度。40三、RIA的分離方法指分離標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）和游離標(biāo)記抗原（F）的方法。根據(jù)使用的分離劑不同可以分為：非特異性分離方法：利用物理、化學(xué)或生物化學(xué)的方法如吸附、過(guò)濾、沉淀等。特異性分離方法：利用免疫反應(yīng)的特異性來(lái)進(jìn)行分離的方法如雙抗體法等。41（一）分離方法的要求分離完全、快速。不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過(guò)程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、PH值等）的影響小。操作簡(jiǎn)便，分離劑來(lái)源豐富、價(jià)廉。42（二）非特異性分離方法1、吸附法：利用表面活性物質(zhì)將反應(yīng)液中的中小分子，即游離部分F吸附，離心后將大分子B留在上清夜中達(dá)到分離的目的。常用的表面活性物質(zhì)是葡聚糖凝膠和活性碳顆粒。43過(guò)濾法：用一定規(guī)格孔徑的濾膜過(guò)濾，大分子不能通過(guò)而留在濾膜上，達(dá)到分離的目的。常用0.22μm的醋酸纖維薄膜。44沉淀法：在溶液中，大分子的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物由一層水分子膜所包被，使其能夠溶解在溶液里。在溶液中加入一定量的沉淀劑如聚乙二醇，乙醇等可以破壞大分子的水包膜，使大分子互相靠攏，形成更大的分子而沉淀下來(lái)。45（三）特異性分離方法1、雙抗體法：用待測(cè)抗原的抗體（第一抗體，Ab1）作為抗原去免疫另一種屬的動(dòng)物而產(chǎn)生新的抗體（第二抗體，Ab2），Ab2可以和Ab1特異性結(jié)合而形成更大的Ag-Ab1-Ab2三聯(lián)復(fù)合物而沉淀。此法特異、高效、非特異結(jié)合低、重復(fù)性好。462、固相法：將第二抗體用一定的方法涂在試管等容器的內(nèi)壁上，然后直接在試管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，平衡后抗原抗體復(fù)合物連接在試管壁上，直接將上清液倒掉后就可以測(cè)定試管的放射性，十分方便。473、磁性微粒分離技術(shù)是一種新興的分離技術(shù)。磁性微粒是用高分子材料和金屬離子如Fe3O4為原料，聚合而成的一種以金屬離子為核心，外層則均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。48使用時(shí)磁性微粒經(jīng)過(guò)特異性抗體包被制成的免疫磁性微粒以懸浮液狀態(tài)存在于反應(yīng)溶液中，在反應(yīng)中與抗原結(jié)合形成復(fù)合體后，當(dāng)受外加磁場(chǎng)吸引的作用磁性微?？煽焖俪两刀孕蟹蛛x，無(wú)需離心沉淀，因而使操作過(guò)程大為簡(jiǎn)化。49磁化分離技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)是：非特異結(jié)合率低；磁化固相顆粒在反應(yīng)系統(tǒng)呈懸浮狀態(tài)，便于和抗原結(jié)合，縮短了反應(yīng)平衡時(shí)間；磁化顆粒表面積大，制成的固相抗體可含較多的抗體量；利用磁性分離架，不用抽吸，分離完全，操作簡(jiǎn)便。50四、測(cè)量?jī)x器γ射線探測(cè)器（γ免疫計(jì)數(shù)器）：γ射線液體閃爍計(jì)數(shù)器(liquidscintillationcounter)：β射線51五、RIA的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高：一般化學(xué)分析法的檢出極限為10-3～10-6g，而RIA通常為10-9(ng)、10-12(pg)，甚至10-15(fg)、10-18(ag)52特異性強(qiáng)：RIA是基于抗原抗體免疫結(jié)合反應(yīng)，由于抗原—抗體免疫反應(yīng)專一性強(qiáng)。良好的特異性抗體，能識(shí)別化學(xué)結(jié)構(gòu)上非常相似的物質(zhì)，甚至能識(shí)別立體異構(gòu)體。被測(cè)物-----抗原53應(yīng)用范圍廣：據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前至少已有300多種生物活性物質(zhì)已建立了RIA。它幾乎能應(yīng)用于所有激素的分析（包括多肽類和固醇類激素），還能用于各種蛋白質(zhì)、腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原以及一些小分子物質(zhì)（如環(huán)型核苷酸等）和藥物（如地高辛、毛地黃甙等）的分析。近年來(lái)由于小分子半抗原制備抗體的技術(shù)有很大的發(fā)展，有人預(yù)測(cè)幾乎所有的生物活性物質(zhì)，只要其含量不低于RIA的探測(cè)極限，都可建立適當(dāng)?shù)腞IA法。54操作簡(jiǎn)便，商品化程度高：RIA所需試劑品種不多，便于制成配套試劑盒；加樣程序簡(jiǎn)單,一次能分析大量標(biāo)本；反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)；測(cè)量和數(shù)據(jù)處理易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；RIA屬體外分析技術(shù)，對(duì)患者無(wú)任何輻射危害。操作簡(jiǎn)便，成本低。血清、血漿、體液、組織勻漿等樣品不加提純就可直接測(cè)量。55六、RIA的質(zhì)量控制一個(gè)理想的、沒(méi)有誤差的“完美”測(cè)定，應(yīng)該是標(biāo)本樣品的分析物無(wú)論是在一次測(cè)定中的任何位置，無(wú)論是重復(fù)測(cè)定幾次，甚至在不同實(shí)驗(yàn)室所測(cè)得的結(jié)果都是一樣的，而且所測(cè)值就是這個(gè)樣品的真值。但是，在實(shí)際工作中，這種理想的測(cè)定是不可能達(dá)到的。任何一種分析方法都會(huì)產(chǎn)生誤差。56一個(gè)完善的質(zhì)量控制體系應(yīng)包括兩個(gè)環(huán)節(jié)：生產(chǎn)廠家應(yīng)該建立嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)程序。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)控）和實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)量控制（室間質(zhì)控）。57（一）誤差的分類和來(lái)源：根據(jù)來(lái)源不同的誤差，可以把實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的誤差分為兩類：系統(tǒng)誤差隨機(jī)誤差58系統(tǒng)誤差：是由于試劑、儀器或操作方法上一個(gè)固定的缺陷而造成整批結(jié)果傾向性的偏差，影響了結(jié)果的正確性。系統(tǒng)誤差引起的測(cè)定結(jié)果的偏差是固定的偏大或偏小。系統(tǒng)誤差是可以避免的。59隨機(jī)誤差：是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各種偶然因素造成同一樣品多次測(cè)定的結(jié)果不一致。誤差的出現(xiàn)是隨機(jī)的，與真實(shí)值的偏離是雙向性的，可大可小。隨機(jī)誤差無(wú)法避免。60（二）質(zhì)量控制質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來(lái)自試劑藥盒和測(cè)量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。具體作用有：檢查誤差的程度，決定測(cè)定結(jié)果的取舍。識(shí)別誤差的來(lái)源并消除其原因。改進(jìn)測(cè)定方法的設(shè)計(jì)以提高質(zhì)量。61（三）RIA質(zhì)量控制指標(biāo)包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制和實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)量控制側(cè)重于對(duì)檢測(cè)質(zhì)量的控制，保證從樣品收集到發(fā)出結(jié)果報(bào)告的整個(gè)過(guò)程中能及時(shí)發(fā)現(xiàn)各種誤差，并分析原因，找出糾正的方法。質(zhì)量控制的指標(biāo)包括：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性62精密度（precision）：精密度是指在一定條件下，同一實(shí)驗(yàn)方法對(duì)同一樣品多次重復(fù)測(cè)定所得到的結(jié)果之間的離散程度，即結(jié)果的一致性。主要反映隨機(jī)誤差的大小。主要用變異系數(shù)或繪制精密度圖的方法來(lái)評(píng)價(jià)。63準(zhǔn)確度（accuracy）：是指測(cè)量值與真值的符合程度，其偏離真值的誤差就叫做偏差。在實(shí)際工作中我們用設(shè)置質(zhì)控樣品、測(cè)定回收率或進(jìn)行健全性評(píng)價(jià)的方法來(lái)判斷準(zhǔn)確度。64質(zhì)量控制樣品質(zhì)量控制樣品是含有已知?jiǎng)┝看郎y(cè)物的血清樣本。質(zhì)控樣品和待測(cè)樣品為同一種物質(zhì)，具有相同的生物和免疫活性。質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)準(zhǔn)確定量并有合理的濃度范圍。通常是根據(jù)待測(cè)物在人體血清內(nèi)的正常濃度制定高、中、低三個(gè)劑量水平的質(zhì)控樣品。使用時(shí)將質(zhì)控樣品分置在待測(cè)樣品的不同位置中同時(shí)檢測(cè)。65回收率的測(cè)定：設(shè)置回收管和對(duì)照管，在對(duì)照管中加入待測(cè)樣品，回收管中加入等量待測(cè)樣品和已知量的分析物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)后計(jì)算其回收率。一般的回收率的要求是90％～110％。66健全性評(píng)價(jià)：主要用于評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的免疫活性是否一致。用反應(yīng)緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品稀釋曲線，如果樣品與標(biāo)準(zhǔn)品免疫活性相同，得到的曲線應(yīng)該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性實(shí)驗(yàn)。67靈敏度（sensitivity）：是指RIA方法剛能與不含有標(biāo)準(zhǔn)抗原的零標(biāo)準(zhǔn)管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上區(qū)別開來(lái)的抗原最低劑量，即該RIA方法的最小可檢測(cè)量。確定靈敏度的方法主要有：同一樣品10次測(cè)量結(jié)果的B/B0＝90％的劑量的平均值作為最小可測(cè)量。以10次測(cè)量結(jié)果的B0管結(jié)合率均值減去2SD（標(biāo)準(zhǔn)差）的結(jié)合率的劑量對(duì)應(yīng)值為最小可測(cè)量。684、特異性：方法的特異性主要取決于抗體的特異性。用抗體的交叉反應(yīng)率來(lái)表示。5、穩(wěn)定性：測(cè)量結(jié)果的穩(wěn)定性可以通過(guò)劑量反應(yīng)曲線的各個(gè)參數(shù)的穩(wěn)定性來(lái)間接反映。如標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距，零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率的75%、50%、25%處的劑量值(ED75、ED50、ED25等)。69七、RIA的方法學(xué)（一）反應(yīng)方式：平衡加樣法：也稱一步法，是將非標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗原和抗體同時(shí)加入反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：使非標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗原兩者與抗體有相同的反應(yīng)幾率，操作方便，精密度較好，穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度較差70順序加樣法：先將非標(biāo)記抗原與抗體溫育反應(yīng)一定時(shí)間（6～24小時(shí)），形成抗原抗體復(fù)合物后，然后再加入標(biāo)記抗原短時(shí)間（1～4小時(shí)）溫育后中止反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：使非標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的幾率比標(biāo)記抗原高，提高了非標(biāo)記抗原的競(jìng)爭(zhēng)能力，提高了方法的靈敏度。71反應(yīng)介質(zhì)：緩沖液：(pH值：7.4～7.8)緩沖液為RIA提供一個(gè)適合的反應(yīng)環(huán)境，是RIA成敗的關(guān)鍵。常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液，Tris-HCL緩沖液等。離子強(qiáng)度：0.05～0.1mol/l離子強(qiáng)度過(guò)高會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)，過(guò)低會(huì)降低緩沖能力，引起反應(yīng)系統(tǒng)PH值的變化，同樣會(huì)影響抗原抗體反應(yīng)。72添加劑：5％牛血清白蛋白：減少反應(yīng)試管對(duì)微量抗原、抗體的吸附。01mol/lEDTA鈉鹽：多功能的螯合劑，可以去除樣品中的鈣鎂離子。05％疊氮鈉：防腐劑。73（三）反應(yīng)的溫度和時(shí)間溫度升高，抗原抗體結(jié)合的親和力要下降，溫度每升高10℃，抗原抗體結(jié)合達(dá)到平衡的速度約提高一倍，達(dá)到平衡的時(shí)間縮短，反應(yīng)時(shí)間縮短。溫度降低，親和常數(shù)提高，增加了反應(yīng)的靈敏度。74RIA的操作一般包括加樣、孵育、分離、測(cè)量和數(shù)據(jù)處理5個(gè)部分。加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對(duì)象孵育的溫度和時(shí)間不同，一般是37℃。分離：選擇好的分離方法進(jìn)行分離。測(cè)量：測(cè)量游離或結(jié)合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)物濃度的計(jì)算。（四）操作基本步驟#202275免疫放射分析immunoradiometricassay,IRMA76*Ab+Ag-*Ab+*AbAg（B）（F）在體外條件下,利用Ag與過(guò)量的*Ab的非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性復(fù)合物的量來(lái)計(jì)算出Ag量的一種超微量分析技術(shù)。基本原理77基本原理免疫放射分析是一種非競(jìng)爭(zhēng)性的抗原抗體反應(yīng)，是用過(guò)量的放射性標(biāo)記抗體來(lái)測(cè)定樣品中的抗原，其中標(biāo)記抗體是過(guò)量的，抗原全部是非標(biāo)記的。將放射性核素標(biāo)記在抗體上，用過(guò)量的抗體與抗原結(jié)合，反應(yīng)平衡后，用分離方法除去多余的抗體，測(cè)量抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性。利用抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性活度與抗原劑量之間的函數(shù)關(guān)系來(lái)測(cè)定待測(cè)抗原的量。78IRMA的基本方法根據(jù)IRMA的分離方法一般可以分為：雙抗夾心法:（最常用）將分離抗體涂在反應(yīng)容器的壁上，稱固相抗體。固相抗體先于抗原反應(yīng)，形成固相抗體－抗原復(fù)合物，再與標(biāo)記抗體反應(yīng)，形成固相抗體－抗原－標(biāo)記抗體復(fù)合物附著在管壁上，傾去上清液直接測(cè)量反應(yīng)容器的放射性。7980標(biāo)記第三抗體法：用雙抗夾心法中的第二抗體（標(biāo)記抗體）作為抗原免疫其他的動(dòng)物獲得的抗體為第三抗體。反應(yīng)后得到固相抗體－抗原－第二抗體－標(biāo)記第三抗體的復(fù)合物。一般第三抗體是由兔抗鼠IgG的抗血清制成的，對(duì)于所有使用小鼠IgG作為第二抗體的反應(yīng)系統(tǒng)都能形成抗原抗體復(fù)合物，又稱為通用性標(biāo)記抗體。81生物素－親和素系統(tǒng)：一個(gè)抗體分子可以連接多個(gè)生物素分子，而每一個(gè)生物素分子都可以連接一個(gè)親和素