32基因工程的基本操作程序-2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物考點(diǎn)（人教版2019選擇性必修3）

3.2基因工程的基本操作程序考點(diǎn)精講考點(diǎn)1：第一步：目的基因的篩選與獲取1.在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如與生物抗逆性、生產(chǎn)藥物、毒物降解、工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是Bt抗蟲蛋白基因。從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。研究表明，蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)?？茖W(xué)家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。因此Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。2.獲取目的基因的方法有多種。常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶。3.PCR反應(yīng)的過(guò)程（如下圖）【例1】下列不屬于獲得目的基因方法的是(

)A．從基因文庫(kù)中獲取B．利用人工合成法獲得C．利用PCR技術(shù)大量獲得D．利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得【答案】D【詳解】A、獲取目的基因的方法之一是從基因文庫(kù)中獲取，A錯(cuò)誤；B、獲取目的基因的方法之一是利用人工合成法獲得，B錯(cuò)誤；C、獲取目的基因的方法之一是利用PCR技術(shù)大量獲得，C錯(cuò)誤；D、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法，而不是獲得目的基因的方法，D正確。【例2】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述若干次循環(huán)：90℃以上使模板DNA解聚為單鏈→50℃左右下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR反應(yīng)過(guò)程的敘述中，不正確的是（

）A．變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B．復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成C．延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比，所需要酶的最適溫度較高【答案】C【詳解】A、變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，使DNA雙鏈得以打開，體內(nèi)DNA復(fù)制利用解旋酶打開氫鍵，A正確；B、復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的，B正確；C、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，相當(dāng)于DNA的大量復(fù)制。所以在形成新的DNA過(guò)程中，所需要的原料是四種脫氧核苷酸，C錯(cuò)誤；D、PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比，所需要酶的最適溫度較高，D正確。故選C?？键c(diǎn)2：第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建1．構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的。(1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2．基因表達(dá)載體的組成3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建的過(guò)程【例3】下圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是（）A．基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建B．基因表達(dá)載體的構(gòu)建并不一定相同C．圖中啟動(dòng)子位于目的基因的首端，是核糖體識(shí)別和結(jié)合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因【答案】C【詳解】A、基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，A正確；B、不同基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程不一定相同，B正確；C、啟動(dòng)子位于基因編碼區(qū)的上游，不是核糖體而是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，C錯(cuò)誤；D、抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因，D正確。故選C?！纠?】下圖為培育某種轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的過(guò)程示意圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）實(shí)施基因工程的核心操作是_____________________________________________________，目的是___________________________________________________________________________。（2）圖中將含抗蟲基因的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌前，常用________處理農(nóng)桿菌。一般情況下，不能用未處理的農(nóng)桿菌作為受體細(xì)胞，原因是______________________________________________。（3）重組Ti質(zhì)粒上的青霉素抗性基因是作為________________。含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與愈傷組織在培養(yǎng)基2上共同培養(yǎng)的目的是_______________________________________________。由植物未成熟的胚獲得愈傷組織的過(guò)程稱為____________________。（4）培養(yǎng)基2與培養(yǎng)基3中所添加物質(zhì)的主要區(qū)別是除了特定的、起篩選作用的物質(zhì)外，還有____________________________________________________的不同?！敬鸢浮炕虮磉_(dá)載體的構(gòu)建

使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)并能遺傳給子代Ca2+

未處理的農(nóng)桿菌吸收質(zhì)粒的能力極弱

標(biāo)記基因

篩選得到含有重組質(zhì)粒的愈傷組織

脫分化

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的濃度及比例【詳解】（1）基因工程的核心操作時(shí)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；目的是使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)并能遺傳給子代；（2）含抗蟲基因的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌之前，常用Ca2+處理農(nóng)桿菌獲得感受態(tài)細(xì)胞；未處理的農(nóng)桿菌由于吸收質(zhì)粒的能力極弱，一般不用作受體細(xì)胞；（3）重組Ti質(zhì)粒上的青霉素抗性基因是作為標(biāo)記基因；含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與愈傷組織在培養(yǎng)基2上共同培養(yǎng)的目的是篩選得到含有重組質(zhì)粒的愈傷組織；由植物未成熟的胚獲得愈傷組織的過(guò)程稱為脫分化；（4）培養(yǎng)基2與培養(yǎng)基3分別用于篩選愈傷組織與培養(yǎng)愈傷組織，所以添加物質(zhì)中，還有生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的濃度比例不同。考點(diǎn)3：第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1．轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法受體細(xì)胞類型方法說(shuō)明特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→將目的基因整合到植物細(xì)胞染色體的DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞→目的基因表達(dá)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)用Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效【例5】下列有關(guān)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的敘述，正確的是（

）A．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法B．原核細(xì)胞有繁殖快、遺傳物質(zhì)少等特點(diǎn)，可用于生產(chǎn)各種有生物活性的蛋白質(zhì)C．基因槍法是將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞中最為有效的方法D．可將含有目的基因的植物病毒作為載體導(dǎo)入Ca2+處理后的大腸桿菌細(xì)胞【答案】A【詳解】A、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，A正確；B、原核細(xì)胞沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工，故生產(chǎn)的蛋白質(zhì)可能沒(méi)有生物活性，B錯(cuò)誤；C、顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞中最為有效的方法，C錯(cuò)誤；D、植物病毒只侵染植物細(xì)胞，故可將含有目的基因的植物病毒作為載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，D錯(cuò)誤。故選A?？键c(diǎn)4：第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定1．分子水平檢測(cè)。(1)通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原——抗體雜交，檢測(cè)目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)。2．個(gè)體水平鑒定。包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性及抗性程度。基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品活性進(jìn)行比較等?！纠?】科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草井培有成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙本，培育過(guò)程如圖1所示，表格所示為相關(guān)限制酶識(shí)別序列及切制位點(diǎn)。回答下列問(wèn)題:限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ識(shí)別序列及切割位點(diǎn)G↓GATCCCCTAG↑GT↓GATCAACTAG↑T↓GATCCTAG↑A↓AGCTTTTCGA↑A(1)表中Sau3AI酶切的DNA末端與BamHI酶切的DNA末端連接，該連接序列______________(填“能”、“不能“或“不一定能")被BamHI酶識(shí)別。質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用圖1中_______________________兩種限制酶切割。(2)若通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增抗鹽基因，除了模板外還需提供__________________________________________________________________________________________________________等物質(zhì)。(3)步驟①構(gòu)建的基因表達(dá)載體，除圖I中質(zhì)粒所示結(jié)構(gòu)外，還需具有____________________________________________及目的基因:步驟②中需先用______________處理農(nóng)桿菌以便將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞:步驟③中通常需要添加酚類物質(zhì)，其目的是___________________________________________________________________________________。(4)基因工程中的檢測(cè)篩選是一個(gè)重要的步驟。為篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，上圖2表示運(yùn)用影印培養(yǎng)法(使一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法)檢測(cè)基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入了農(nóng)桿菌。培養(yǎng)基B除了含有農(nóng)桿菌生長(zhǎng)繁殖必需的成分外，還必須加入_________________________________________________。從檢測(cè)篩選的結(jié)果分析，不含目的基因的是菌落_________________(填數(shù)字)中的細(xì)菌?！敬鸢浮?1)不一定能

BamHI和HindⅢ(2)兩種引物、酶（耐熱的DNA聚合或熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶）、原料（4種脫氧核苷酸）(3)啟動(dòng)子、終止子

Ca2+

吸引農(nóng)桿菌移向煙草細(xì)胞，有利于目的基因成果轉(zhuǎn)化(4)氨芐青霉素(或氨芐青霉素和四環(huán)素)

4和6【分析】圖1所示為轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程，其中①表示重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程；②表示重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；③表示采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④表示植物組織培養(yǎng)。圖2是篩選含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的過(guò)程，培養(yǎng)基A和B中應(yīng)該分別加入氨芐青霉素、四環(huán)素。表格中BamHI、Bcll和Sau3A三種切割位點(diǎn)有共同的序號(hào)GATC，Sau3Al酶能能切割BamHl、Bcll和Sau3AI三種切割位點(diǎn)。(1)若Sau3AI酶切的DNA末端，產(chǎn)生的末端是和，BamHI酶切的DNA末端，產(chǎn)生的末端是和，末端連接后為或者序列可能是GGATCC，也可能不是，不一定能被BamHI酶識(shí)別。為了防止目的基因的外源DNA片段和質(zhì)粒自身環(huán)化，應(yīng)選用BamHI和HindⅢ酶對(duì)外源DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，可以防止自身環(huán)化。(2)在植物基因工程操作過(guò)程中，研究人員首先獲取了抗鹽基因（目的基因），并可以采用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，該技術(shù)需要的條件有：兩種引物、酶（耐熱的DNA聚合或熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶）、原料（4種脫氧核苷酸）、模板（目的基因的兩條脫氧核苷酸鏈）。(3)基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子和復(fù)制原點(diǎn)，步驟所使用的運(yùn)載體中未標(biāo)出的必需元件有啟動(dòng)子、終止子；步驟②中需先用Ca2+處理農(nóng)桿菌，讓細(xì)胞壁通過(guò)性增加，以便將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞；為吸引農(nóng)桿菌移向煙草細(xì)胞，有利于目的基因成果轉(zhuǎn)化，通常在步驟③中通常需要添加酚類物質(zhì)。(4)基因工程中的檢測(cè)篩選是一個(gè)重要的步驟。常根據(jù)標(biāo)記基因設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，最終篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。圖2表示影印培養(yǎng)法，分析可知，培養(yǎng)基B除了含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖必需的成分外，還含有氨芐青霉素(或氨芐青霉素和四環(huán)素)，能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌含有非重組質(zhì)粒(有氨芐青霉素抗性基因)，不能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌只含有重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒構(gòu)建破壞了氨芐青霉素抗性基因，農(nóng)桿菌失去相應(yīng)抗性)，與培養(yǎng)基A作對(duì)比可知，含有目的基因(重組質(zhì)粒)的是4和6菌落中的細(xì)菌?？键c(diǎn)5：實(shí)驗(yàn)：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（一）實(shí)驗(yàn)原理1．DNA片段的擴(kuò)增。2．瓊脂糖凝膠電泳（二）方法步驟2．混合。3．離心。4．反應(yīng)。5．根據(jù)待分離的DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制合適的瓊脂糖凝膠，一般配制質(zhì)量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液，并加入適量的核酸染料混勻。6．將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入加樣孔。7．接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5_V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。8．電泳結(jié)束后，取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（三）操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。【例7】進(jìn)行PCR反應(yīng)的具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為（）①離心使反應(yīng)液集中的離心管底部②用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分③按配方準(zhǔn)備好各組分④進(jìn)行PCR反應(yīng)⑤設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序A．②③⑤④① B．①⑤③②④C．④②⑤③① D．③②①⑤④【答案】D【詳解】使用PCR技術(shù)的具體操作順序是：按配方準(zhǔn)備好各組分→用微量移液器將各組分依次加入微量離心管中→離心使反應(yīng)液集中在離心管底部→設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序→進(jìn)行PCR反應(yīng)。故選D?！纠?】PCR技術(shù)是把某一DNA片段在酶的作用下，在體外合成許多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或DNA分子片段；電泳技術(shù)則是在外電場(chǎng)作用下，利用分子攜帶的凈電荷不同，把待測(cè)分子的混合物放在一定的介質(zhì)(如瓊脂糖凝膠)中進(jìn)行分離和分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，利用它可分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等物質(zhì)作親子鑒定。圖中是電泳裝置及相應(yīng)電泳結(jié)果。（1）電泳和葉綠體色素分離采用的紙層析法比較，后者使用